一种抗人α-防御素-1单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗人α‑防御素‑1单克隆抗体及其应用，属于生物医学技术领域。所述抗人α‑防御素‑1单克隆抗体包括重链和轻链，所述重链的可变区的三个互补决定区序列如SEQ ID NO.3‑5所示，所述轻链的可变区的三个互补决定区序列如SEQ ID NO.7‑9所示，本发明专利技术提供的抗人α‑防御素‑1单克隆抗体，特异性阻断了HNP1‑3与P2X7之间的作用，从而阻止HNP1‑3引起的血管内皮细胞的死亡，为开发预防或治疗脓毒症的药物提供一种新的思路。

A monoclonal antibody against human alpha defensin -1 and its application

The invention discloses a monoclonal antibody against human alpha defensin 1 and its application, belonging to the technical field of biomedicine. The monoclonal antibody against human alpha defensin_1 comprises a heavy chain and a light chain. The sequence of three complementary determinants of the variable region of the heavy chain is shown as SEQ ID NO.3_5. The sequence of three complementary determinants of the variable region of the light chain is shown as SEQ ID NO.7_9. The monoclonal antibody against human alpha defensin_1 provided by the present invention is specific. Heterosexual blockade of the interaction between HNP1_3 and P2X7, thereby preventing the death of vascular endothelial cells caused by HNP1_3, provides a new idea for the development of drugs to prevent or treat sepsis.

【技术实现步骤摘要】
一种抗人α-防御素-1单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种抗人α-防御素-1单克隆抗体及其应用。
技术介绍
防御素是生物体产生的一类有直接杀菌作用和免疫调节作用等多种生物学功能的阳离子抗菌肽，是机体固有免疫的重要组成部分。根据防御素分子内二硫键构成的不同，人防御素分为-防御素和-防御素。根据人-防御素来源的不同，又分为人-防御素1-4(又称人中性粒细胞肽1-4，HNP1-4)和人-防御素5-6(又称人防御素5-6，HD5-6)，前者主要来自中性粒细胞，后者主要来自小肠潘氏细胞。其中HNP1-3分子之间的差异很小，仅N端1个氨基酸残基不同，因此常将其作为一个整体进行研究。HNP1-3约占中性粒细胞嗜天青颗粒蛋白的30％-50％，是中性粒细胞在感染、炎症过程中最早释放的警报素之一。脓毒症(Sepsis)是感染引起的机体反应异常导致危及生命的器官功能损害，进一步可发展为脓毒性休克和多器官功能损害，是一种发病率高、死亡率高、医疗费用高的疾病。脓毒症的发病机制与早期炎症反应的过度激活、晚期免疫功能的抑制、凝血/抗凝系统失平衡以及血管内皮屏障功能障碍等密切相关。目前脓毒症尚无有效特异的治疗手段。既往研究发现，脓毒症发生后，血浆HNP1-3浓度升高，提示其在脓毒症发生发展中有重要作用。编码HNP1-3的基因DEFA1/DEFA3的拷贝数与脓毒症器官功能障碍的发生密切相关，高拷贝数DEFA1/DEFA3基因是脓毒症器官功能障碍的独立危险因素。而且，携带高拷贝数DEFA1/DEFA3基因的转基因小鼠脓毒症后死亡率明显增加，器官损害加重，血管通透性增高，血管内皮细胞焦亡(pyroptosis)增加。进一步研究发现，高浓度HNP-1能与内皮细胞P2X7受体(P2X7受体是对二价阳离子有较强选择性的ATP门控的离子通道，参与细胞信号转导，介导细胞毒性作用，活化并诱导宿主细胞死亡)相作用，通过一系列信号通路，激活caspase-1炎性小体，导致内皮细胞焦亡。迄今为止，临床上还没有治疗脓毒症的药物。根据患者的遗传信息，使用抗体特异性阻断HNP-1与P2X7之间的作用为脓毒症的治疗提供了新的思路。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗人α-防御素-1的抗体，能够特异性阻断HNP-1与P2X7之间的作用，从而阻止下游炎性小体的活化和细胞焦亡，使之成为一种可以治疗脓毒症的药物。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术针对HNP-1分子上与P2X7之间发生作用的氨基酸序列设计了抗原序列Cys-Tyr-Cys-Arg-Ile-Pro-Ala，利用杂交瘤技术并筛选获得能够特异性阻断HNP-1与P2X7之间作用的单克隆抗体。本专利技术提供了一种抗人α-防御素-1单克隆抗体，包括重链和轻链，所述重链的可变区的三个互补决定区序列分别为：CDR1：Gly-Leu-Asn-Ile-Lys-Asp-Thr-Phe-Met-His；CDR2：Arg-Ile-Asp-Pro-Ala-Ile-Gly-Tyr-Thr-Lys-Tyr-Asp-Pro-Lys-PheGln-Gly；CDR3：Trp-Pro-Leu-Ile-Ser-Thr-Ile-Val-Glu-Pro-Phe-Thr-Ser；所述轻链的可变区的三个互补决定区序列分别为：CDR1：Arg-Ala-Ser-Lys-Ser-Val-Ser-Thr-Ser-Gly-Tyr-Ser-Tyr-Met-His；CDR2：Leu-Val-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser；CDR3：Gln-His-Ile-Arg-Glu-Leu-Thr-Arg-Ser。作为优选，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术所述的抗人α-防御素-1单克隆抗体可以通过利用筛选获得的杂交瘤细胞注射动物腹腔，从腹水中纯化获得高亲和力的单克隆抗体；也可以通过基因克隆及蛋白原核表达技术获得。本专利技术还提供了编码所述的抗人α-防御素-1单克隆抗体的核苷酸序列，包含如SEQIDNO.10所示的编码所述重链可变区的核苷酸序列和如SEQIDNO.11所示的编码所述轻链可变区的核苷酸序列。本专利技术提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体与氨基酸序列为Cys-Tyr-Cys-Arg-Ile-Pro-Ala的多肽特异性结合。研究证明本专利技术提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体能够与人α-防御素-1特异性结合，两者亲和力(Kd)达到4.02×10-8M。由于HNP-1、HNP-2和HNP-3分子之间的差异很小，仅N端的1个氨基酸残基不同，本专利技术提供的单克隆抗体是针对HNP-1的第二位氨基酸残基开始的氨基酸序列作用，因此，本专利技术提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体可以应用于制备检测人α-防御素-1、人α-防御素-2或人α-防御素-3的试剂盒。研究证明本专利技术提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体能够与HNP-1特异性结合，进而阻断HNP-1与P2X7受体的结合，因此，本专利技术提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体也可以应用于制备阻断HNP-1、HNP-2或HNP-3与P2X7受体之间作用的药物。研究证明本专利技术提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体特异性阻断HNP-1上与P2X7受体结合的部位，阻止炎性体的活化，阻止内皮细胞焦亡，从而发挥对脓毒症的保护作用。因此，本专利技术提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体可以应用于制备阻断血管内皮细胞焦亡的药物。研究证明本专利技术提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体能够显著改善携带高拷贝数DEFA1/DEFA3基因的脓毒症模型预后，发挥了显著的治疗作用。因此，本专利技术提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体可以应用于制备预防或治疗脓毒症的药物。本专利技术还提供了一种预防或治疗脓毒症的药物组合物，包括有效剂量的所述的抗人α-防御素-1单克隆抗体和药学上可接受的载体。与现有技术相比，本专利技术具备的有益效果：(1)已有的HNP-1抗体主要目的是作为分子生物学实验的一抗来使用，本专利技术提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体，特异性阻断了HNP1-3与P2X7之间的作用，从而阻止HNP1-3引起的血管内皮细胞的死亡，为开发预防或治疗脓毒症的药物提供一种新的思路。(2)本专利技术提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体廉价易得，可以大规模生产，十分有利于开发成为治疗脓毒症的药物。附图说明图1为Western-blot方法检测炎性小体caspase-1活化水平。图2为细胞上清中乳酸脱氢酶含量。图3为抗HNP-1单克隆抗体改善携带高拷贝数DEFA1/DEFA3基因的转基因小鼠的脓毒症预后。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例11、多肽抗原表位设计与合成从NCBI获取HNP-1和P2X7的蛋白序列，采用同源模拟和分子对接等方法综合预测HNP-1蛋白与P2X7作用的可能特异性位点，设计抗原多肽序列HNP-1-N28：Cys-Tyr-Cys-Arg-Ile-Pro-Ala(SEQIDNO.1)，委托中肽生化有限公司进行多肽合成，并与KLH偶联为KLH-HNP-1-N28。2、单克隆抗体制备用KLH-HNP-1-N28免疫8周龄BALB/C小鼠。免疫方式为：首次免疫以皮下注射KLH-HN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗人α‑防御素‑1单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链的可变区的三个互补决定区序列分别为：CDR1：Gly‑Leu‑Asn‑Ile‑Lys‑Asp‑Thr‑Phe‑Met‑His；CDR2：Arg‑Ile‑Asp‑Pro‑Ala‑Ile‑Gly‑Tyr‑Thr‑Lys‑Tyr‑Asp‑Pro‑Lys‑PheGln‑Gly；CDR3：Trp‑Pro‑Leu‑Ile‑Ser‑Thr‑Ile‑Val‑Glu‑Pro‑Phe‑Thr‑Ser；所述轻链的可变区的三个互补决定区序列分别为：CDR1：Arg‑Ala‑Ser‑Lys‑Ser‑Val‑Ser‑Thr‑Ser‑Gly‑Tyr‑Ser‑Tyr‑Met‑His；CDR2：Leu‑Val‑Ser‑Asn‑Leu‑Glu‑Ser；CDR3：Gln‑His‑Ile‑Arg‑Glu‑Leu‑Thr‑Arg‑Ser。

【技术特征摘要】
1.一种抗人α-防御素-1单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链的可变区的三个互补决定区序列分别为：CDR1：Gly-Leu-Asn-Ile-Lys-Asp-Thr-Phe-Met-His；CDR2：Arg-Ile-Asp-Pro-Ala-Ile-Gly-Tyr-Thr-Lys-Tyr-Asp-Pro-Lys-PheGln-Gly；CDR3：Trp-Pro-Leu-Ile-Ser-Thr-Ile-Val-Glu-Pro-Phe-Thr-Ser；所述轻链的可变区的三个互补决定区序列分别为：CDR1：Arg-Ala-Ser-Lys-Ser-Val-Ser-Thr-Ser-Gly-Tyr-Ser-Tyr-Met-His；CDR2：Leu-Val-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser；CDR3：Gln-His-Ile-Arg-Glu-Leu-Thr-Arg-Ser。2.如权利要求1所述的抗人α-防御素-1单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：方向明，陈齐兴，舒强，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33