两个链肽类化合物的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及两个链肽类化合物的制备方法和应用，具体是涉及链肽类化合物Rhabdopeptide J和Changshamycin D，从昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdus budapestensis的液体发酵物中分离得到，对疟原虫的具有抑制活性，可用于制备抗疟原虫的药物。两个链肽类化合物可以利用微生物进行液体发酵生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证，利用生物法合成，对环境无污染。

Preparation and application of two chain peptide compounds

The present invention relates to the preparation and application of two chain peptide compounds, Rhabdopeptide J and Changshamycin D, which are separated from the liquid fermentation of entomopathogenic nematode symbiotic bacteria Xenorhabdus budapestensis and have inhibitory activity against Plasmodium and can be used to prepare antimalarial drugs. Things. The two peptides can be produced by liquid fermentation with microorganisms. The process is simple, the cycle is short, the cost is low, the source is guaranteed, and the biosynthesis is non-polluting to the environment.

【技术实现步骤摘要】
两个链肽类化合物的制备方法和应用
本专利技术属于微生物工程
，具体涉及从昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdusbudapestensis的液体发酵物中提取到的两个链肽类化合物(RhabdopeptideJ和ChangshamycinD)及其制备方法与应用。
技术介绍
昆虫病原线虫共生菌是一类寄生于昆虫病原线虫(Entomopathogenicnematodes)肠道内的肠杆菌科细菌，具有对宿主昆虫致病以及与寄主线虫共生的双重特性。它包括与斯氏线虫(Steinernema)共生的致病杆菌属(Xenorhabdus)和与异小杆线虫(Heterorhabditis)共生的发光杆菌属(Photorhabdus)。昆虫病原线虫共生菌能产生多种具有抑菌、杀虫、杀线虫、抗溃疡、抗肿瘤和抗病毒活性的代谢产物，在农业和医药卫生领域具有较大开发潜力和应用前景，已成为一类重要的新型生物资源。疟疾，是由疟原虫引起的经蚊媒传播的寄生虫病。人类对疟疾的记载已有4000多年历史，在五种感染人的疟原虫中，恶性疟原虫危害最为严重，每年引起数百万人死亡。随着文明发展，疟疾防治也由最初的中草药、巫术、蚊帐、纱窗等传统手段逐渐转变为化学抗疟药。目前已知的抗疟药有奎宁、氯喹、阿莫地喹、周效磺胺、DDT杀虫剂、磷酸咯萘啶、甲氟喹、磷酸萘酚喹、磷酸哌喹、磷酸伯氨喹啉、本芴醇、青蒿素及其衍生物。其中，最有效的为青蒿素，其余均已产生抗药性。尽管以青蒿素为基础的联合疗法在临床应用中表现突出，但近年来对青蒿素类药物敏感性监测证实，恶性疟原虫对青蒿素敏感性已明显下降。因此，发掘新型抗疟药、预防潜在风险，依然势在必行。
技术实现思路
为了弥补上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提出具有抗疟活性的两个链肽类化合物的制备方法和应用，对分离到的昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdusbudapestensis的液体发酵物进行提取，得到两个具有抗疟活性的链肽类化合物RhabdopeptideJ和ChangshamycinD，可做为具有抗疟活性的新药物或先导化合物，提取工艺简便环保，缩短了周期，降低了成本。专利技术的目的通过下述技术方案实现的：链肽类化合物(RhabdopeptideJ和ChangshamycinD)，从昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdusbudapestensis的液体发酵物中分离得到，具有下述结构式：RhabdopeptideJ和ChangshamycinD的制备方法，它包括下述步骤：(1)将利用大蜡螟生物诱导法从土样中分离、纯化得到的昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdusbudapestensis菌体接种到每管含有5mLLB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，pH7.0)的18#试管中，在180rpm、28℃条件的摇床上培养18h作为一级种子液，然后将5mL一级种子液接种于含有50mLLB培养基的250mL三角瓶中，在180rpm、28℃条件的摇床上培养18h作为二级种子液，再将20mL二级种子液接种于含有400mLM培养基(葡萄糖6.13g，蛋白胨21.29g，七水合硫酸镁1.5g，硫酸铵2.46g，磷酸二氢钾0.86g，磷酸氢二钾1.11g，硫酸钠1.72g，蒸馏水1L，pH7.2)的2L三角瓶中，在180rpm、28℃条件下发酵6天；(2)将步骤(1)所得的发酵液于4℃、8000rpm离心30min除去菌体，用3％的AmberliteXAD16大孔吸附树脂对上清液吸附4h，收集大孔吸附树脂并放置于28℃的烘箱内烘干，烘干后用甲醇反复洗脱树脂4次，收集甲醇洗脱液进行真空浓缩干燥，得到SN84菌株的甲醇浸膏，将干燥的甲醇浸膏溶解于50％的甲醇溶液中，并用等体积的二氯甲烷萃取四次，收集二氯甲烷相，真空浓缩干燥得到二氯甲烷浸膏F1；(3)将二氯甲烷浸膏F1进行硅胶柱层析(350mm×25mmi.d.)，依次用3倍柱体积的二氯甲烷、二氯甲烷：甲醇＝100:2、二氯甲烷：甲醇＝100:4、二氯甲烷：甲醇＝100:8、二氯甲烷：甲醇＝100:12、二氯甲烷：甲醇＝100:16、二氯甲烷：甲醇＝1:1、甲醇进行洗脱，浓缩100:8(二氯甲烷：甲醇)段得到黄棕色浸膏F2；(4)利用SephadexLH-20凝胶柱层析(1000mm×20mmi.d.)对浸膏F2进行分离纯化(洗脱液为二氯甲烷：甲醇＝1:1)，共得33管，根据薄层层析检测结果合并3-12管得淡黄色固体F3；(5)用高效液相色谱法(高效液相色谱仪：Agilent1260,色谱柱：ZORBAXEclipseXDB250mm×9.4mm,i.d.5μm)对浸膏F3进行梯度洗脱制备，流动相：乙腈/水＝31/69-40/60(v/v)、检测波长：210nm、流速：3.0mL/min、采集时长：35min，共出现五个主要成分，保留时间为18.50min和12.51min的第二和第四成分分别是RhabdopeptideJ和ChangshamycinD。本专利技术的链肽类化合物RhabdopeptideJ和ChangshamycinD对疟原虫的具有抑制活性。本专利技术的链肽类化合物RhabdopeptideJ和ChangshamycinD用于制备抗疟原虫的药物。本专利技术的链肽类化合物RhabdopeptideJ和ChangshamycinD用于制备抗恶性疟原虫的药物。本专利技术的有益效果：1.本专利技术的RhabdopeptideJ和ChangshamycinD均首次被报道具有抗疟活性，可做为具有抗疟活性的新药物或先导化合物；2.本专利技术的RhabdopeptideJ和ChangshamycinD可以利用微生物进行液体发酵生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证；3.本专利技术利用生物法合成RhabdopeptideJ和ChangshamycinD，对环境无污染。附图说明图1为本专利技术的液体发酵工艺流程图。具体实施方式实施例11.昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdusbudapestensis的分离与纯化。将大蜡螟五龄虫投放到土样中，然后将土样反复颠倒，使大蜡螟在土样中分布均匀，将土样存放于25℃的恒温环境中，待大蜡螟死亡后将其取出，用75％酒精和0.01％次氯酸钠对大蜡螟尸体表皮消毒，然后用无菌水冲洗2-3次，将大蜡螟尸体上的水用无菌滤纸上吸干，剪去腹足顶端，将血淋巴液滴到NBTA培养基上，三区划线，28℃条件下培养24-48h。待菌体长出后，挑取单菌落纯化培养，得到昆虫病原线虫共生菌，通过16SrRNA基因进化分析及同源基因序列对比，鉴定为致病杆菌Xenorhabdusbudapestensis，Genbank收录号为KU556153，现保藏在中国典型培养物保藏中心，分类命名为Xenorhabdussp.SN84，地址：武汉珞珈山武汉大学内，保藏编号为CCTCCM2015214，保藏日期为2015年4月9日。2.昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdusbudapestensis的液体发酵活化昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdusbudapestensis，将新鲜的菌体接种到每管含有5mLLB培养基的18#试管中，在180rpm、28℃条件的摇床上培养18h作为一级种子液，然后将5mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.两个链肽类化合物的制备方法和应用，其特征是：链肽类化合物（Rhabdopeptide J和Changshamycin D），从昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdus budapestensis的液体发酵物中分离得到，具有下述结构式：

【技术特征摘要】
1.两个链肽类化合物的制备方法和应用，其特征是：链肽类化合物（RhabdopeptideJ和ChangshamycinD），从昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdusbudapestensis的液体发酵物中分离得到，具有下述结构式：；两个链肽类化合物RhabdopeptideJ和ChangshamycinD的制备方法，它包括下述步骤：（1）将利用大蜡螟生物诱导法从土样中分离、纯化得到的昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdusbudapestensis菌体接种到每管含有5mLLB培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，pH7.0）的18#试管中，在180rpm、28℃条件的摇床上培养18h作为一级种子液，然后将5mL一级种子液接种于含有50mLLB培养基的250mL三角瓶中，在180rpm、28℃条件的摇床上培养18h作为二级种子液，再将20mL二级种子液接种于含有400mLM培养基（葡萄糖6.13g，蛋白胨21.29g，七水合硫酸镁1.5g，硫酸铵2.46g，磷酸二氢钾0.86g，磷酸氢二钾1.11g，硫酸钠1.72g，蒸馏水1L，pH7.2）的2L三角瓶中，在180rpm、28℃条件下发酵6天；（2）将步骤（1）所得的发酵液于4°C、8000rpm离心30min除去菌体，用3%的AmberliteXAD16大孔吸附树脂对上清液吸附4h，收集大孔吸附树脂并放置于28℃的烘箱内烘干，烘干后用甲醇反复洗脱树脂4次，收集甲醇洗脱液进行真空浓缩干燥，得到SN84菌株的甲醇浸膏，将干燥的甲醇浸膏溶解于50％的甲醇溶液中，并用等体积的二氯甲烷萃取四次，收集二氯甲烷相，真空浓缩干燥得到二氯甲烷浸膏F1；（3）将二氯甲烷浸膏F1进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：于志国，陈启军，毕于慧，王建花，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21