用于分析生物聚合物的测定试剂及分析器件制造技术

本发明专利技术的目的在于解决伴随着由核酸构成的生物聚合物的立体结构形成的纳米孔中的生物聚合物测定的阻碍。本发明专利技术提供一种分析器件，其用于分析由核酸构成的生物聚合物，其特征在于，其具备：具备多个具有纳米孔的薄膜部的阵列器件，能够收纳与所述薄膜接触的测定溶液的多个单独槽以及一个通用槽，和所述多个单独槽各自具备的多个电极，其中，向各个所述单独槽和通用槽中与所述薄膜接触地注入所述测定溶液，所述测定溶液的pH在鸟嘌呤碱基的pKa以上且含有铯离子作为电解质的阳离子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于分析生物聚合物的测定试剂及分析器件
本专利技术涉及使用了埋入薄膜的细孔的、用于分析测定对象物、特别是由核酸构成的生物聚合物(DNA等)的测定试剂、器件及方法。
技术介绍
当将含有电解质的溶液与埋入厚度为数～数十nm左右的薄膜的直径为0.9nm～数nm左右的细孔(以下称为纳米孔)接触、在该薄膜的两端间产生电位差时，能够使含有电解质的溶液通过纳米孔。此时，当测定对象物通过纳米孔时，纳米孔周边部的电特性、特别是电阻值发生变化，因此通过检测其电特性的变化，能够对测定对象物进行检测及分析。在测定对象物为生物聚合物的情况下，纳米孔周边部的电特性会根据生物聚合物的单体序列模式而以图案状变化。利用该特性，近年来积极研究了进行生物聚合物的单体序列分析的方法。其中，以生物聚合物通过纳米孔时观测到的离子电流的变化量因单体种类的不同而不同为原理的方式(封闭电流方式)被认为是有前景的。此时，单体序列的分析精度由上述离子电流的变化量决定，因此单体间的离子电流量差越大越优选。上述封闭电流方式与以往方法不同，不需要伴随生物聚合物的片段化的化学操作，能够直接读取生物聚合物。生物聚合物为DNA时期待是新一代DNA碱基序列分析系统，在生物聚合物为蛋白时期待是氨基酸序列分析系统，作为能够解读远比现有方法长的序列长度的系统。作为纳米孔器件，有使用了在埋入脂质双层膜的中心具有细孔的蛋白的生物孔和在通过半导体加工工艺形成的绝缘薄膜上加工有细孔的实心孔这两种。在生物孔中，将埋入脂质双层膜中的改性蛋白(耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA，MycobacteriumsmegmatisporinA)等)的细孔(直径为1.2nm、厚度为0.6nm)作为生物聚合物检测部测定离子电流的变化量。另一方面，在实心孔中，将在由如半导体材料氮化硅的薄膜、石墨烯或二硫化钼这样的单分子层构成的薄膜上形成有纳米孔的结构体用作器件。这样的分析器件以由纳米孔器件、含有测定对象物及电解质的溶液、夹着纳米孔器件的一对电极构成的器件为基本单位进行使用。这样的构成例如记载于专利文献1和非专利文献1。电极典型地采用能够与溶液中的电解质进行电子传递反应(能够进行电化学氧化还原反应)的材质。具体而言，从其电化学的电位稳定性和可靠性的高低的角度出发，常常使用银/银氯化银电极。电解质中最典型地使用pH为中性以下的氯化钾水溶液。其理由在于，氯化物离子能够与银/银氯化银电极发生电子传递反应，钾离子与氯化物离子的电迁移率相等，因此能够充分确保导电率。就实心孔(半导体纳米孔)而言，迄今为止有使用pH为中性以下的氯化钾水溶液来测定由腺嘌呤碱基、胞嘧啶碱基或胸腺嘧啶碱基构成的均聚物的封闭电流量的报告(非专利文献1和非专利文献2)。现有技术文献专利文献专利文献1：美国专利第5795782号说明书专利文献非特許文献1：Venta,K.,etal.,DifferentiationofShortSingle-StrandedDNAHomopolymersinSolid-StateNanopores,ACSNano7(5),p.4629-4636(2013).非专利文献：Lee,M.,etal.,ALow-NoiseSolid-StateNanoporePlatformBasedonaHighlyInsulatingSubstrate,ScientificReports4,7448(2014).
技术实现思路
本专利技术所要解决的课题当使用以往的pH为中性以下的氯化钾水溶液时，存在由核酸构成的生物聚合物形成立体结构而将纳米孔堵塞、阻碍纳米孔中的生物聚合物测定的课题。特别是在钾离子存在下，鸟嘌呤(G)碱基牢固地形成4聚体而将纳米孔堵塞，阻碍生物聚合物测定。因此，无法准确地测定来自鸟嘌呤碱基的封闭电流量。这样的课题例如在非专利文献1中也被提及。另外，在以往的pH为中性以下的氯化钾水溶液中，纳米孔中的单体间的离子电流量差小，因此存在碱基分离度差、最终的单体序列的分析精度降低的课题。例如，非专利文献2中公开了均聚物中的腺嘌呤碱基、胞嘧啶碱基、胸腺嘧啶碱基的封闭电流量重复的结果。用于解决该问题的手段为了解决上述课题，本专利技术人进行了深入研究，结果令人意外地发现，在使用了含有铯离子作为电解质的阳离子且具有比鸟嘌呤碱基的pKa高的pH的测定溶液的情况下，能够防止G碱基的4聚体形成，能够准确地测定由核酸构成的生物聚合物。另外，在使用了上述测定溶液的情况下，还发现显示可根据碱基的种类区别的封闭电流量的差、即碱基分离度良好、能够高精度地分析由核酸构成的生物聚合物序列。由这些发现完成了本专利技术。本专利技术代表性地涉及一种测定试剂，其特征在于，其用于使由核酸构成的生物聚合物通过薄膜上开孔而成的纳米孔、根据电信号的变化分析上述生物聚合物，其含有测定溶液，所述测定溶液的pH在鸟嘌呤碱基的pKa以上且含有铯离子作为电解质的阳离子。本专利技术还涉及一种分析器件，其用于分析由核酸构成的生物聚合物，其具备：具有纳米孔的薄膜；能够收纳与所述薄膜接触的测定溶液的一对槽；和所述各槽上具备的一对电极；其中，向所述各槽中与所述薄膜接触地注入所述测定溶液，所述测定溶液的pH在鸟嘌呤碱基的pKa以上且含有铯离子作为电解质的阳离子。另外，本专利技术还涉及一种分析器件，其用于分析由核酸构成的生物聚合物，其具备：具备多个具有纳米孔的薄膜部的阵列器件；能够收纳与所述薄膜接触的测定溶液的多个单独槽以及一个通用槽；和所述多个单独槽各自具备的多个单独电极；其中，向所述单独槽和通用槽的每一个中与所述薄膜接触地注入所述测定溶液，所述测定溶液的pH在鸟嘌呤碱基的pKa以上且含有铯离子作为电解质的阳离子。此外，本专利技术还涉及一种分析由核酸构成的生物聚合物的方法，其使用上述测定溶液或上述分析器件。本专利技术还涉及pH在鸟嘌呤碱基的pKa以上且含有铯离子作为电解质的阳离子的溶液。该溶液例如可用于使用封闭电流形式的纳米孔分析生物聚合物的方法及器件中。专利技术的效果根据本专利技术，能够消除由核酸构成的生物聚合物的立体结构，能够使纳米孔中的生物聚合物测定顺利地进行。特别是能够消除鸟嘌呤碱基的4聚体，从而正确地测定来自鸟嘌呤碱基的封闭电流量。另外，根据本专利技术，单体间的离子电流差增大，碱基分离度提高，最终的单体序列的解析精度提高。因此，本专利技术的测定试剂、分析器件及分析方法在由核酸构成的生物聚合物的分析、以及利用该分析的试验、诊断、治疗、药物开发、基础研究等领域中是有用的。除上述以外的课题、构成以及效果通过以下的实施方式的说明而得以明确。附图说明图1是表示本专利技术的分析器件的构成的一个实施方式的图。图2是表示本专利技术的消除鸟嘌呤4聚体的机理的图。图3是表示将本专利技术的效果与现有技术比较的实验结果的图。图4是表示本专利技术的碱基分离度提高的实验结果的曲线图。图5是表示本专利技术的分析器件的构成的另一实施方式的图。图6是表示本专利技术的分析器件的构成的另一实施方式的图。图7是表示本专利技术的分析器件的构成的另一实施方式的图。具体实施方式以下，参照附图说明本专利技术的实施方式。本专利技术中，在用于以所谓的封闭电流方式分析生物聚合物的纳米孔器件中，使与具有纳米孔的薄膜接触的测定溶液含有铯作为电解质的阳离子，且pH在鸟嘌呤碱基(N-1位)的pKa以上。鸟嘌呤4聚体将鸟嘌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定试剂，其特征在于，其用于使由核酸构成的生物聚合物通过薄膜上开孔而成的纳米孔、根据电信号的变化分析所述生物聚合物，其含有测定溶液，所述测定溶液的pH在鸟嘌呤碱基的pKa以上且含有铯离子作为电解质的阳离子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.24 JP 2015-2514261.一种测定试剂，其特征在于，其用于使由核酸构成的生物聚合物通过薄膜上开孔而成的纳米孔、根据电信号的变化分析所述生物聚合物，其含有测定溶液，所述测定溶液的pH在鸟嘌呤碱基的pKa以上且含有铯离子作为电解质的阳离子。2.根据权利要求1所述的测定试剂，其特征在于，所述电解质中，含有卤化物离子作为阴离子。3.根据权利要求1所述的测定试剂，其特征在于，所述溶液的pH在鸟嘌呤碱基的pKa以上且pH14以下。4.根据权利要求1所述的测定试剂，其特征在于，所述溶液的pH通过添加氢氧化铯而调节为鸟嘌呤碱基的pKa以上且pH14以下。5.根据权利要求1所述的测定试剂，其特征在于，所述溶液的pH通过符合亨德森-哈塞尔巴尔赫方程：pH＝pKa+log10[HX+]/[X]的pH调节剂，调节为鸟嘌呤碱基(N-1位)的pKa以上且pH14以下，其中，X是指pH调节剂。6.根据权利要求5所述的测定试剂，其特征在于，所述pH调节剂的浓度为100mM以上。7.根据权利要求1所述的测定试剂，其特征在于，所述溶液的铯离子浓度为10mM以上且饱和浓度以下。8.一种分析器件，其特征在于，其用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：后藤佑介，横井崇秀，
申请(专利权)人：株式会社日立高新技术，
类型：发明
国别省市：日本,JP