用于分析样品以检测布鲁塞尔酒香酵母物种的亚硫酸盐/酯抗性酵母的存在的方法以及用于实施该方法的试剂盒技术

本发明专利技术涉及用于分析样品、特别是液体样品如葡萄酒以便检测布鲁塞尔酒香酵母物种的亚硫酸盐/酯抗性酵母的可能存在的方法。该方法包括确定在样品中是否发现属于三倍体酿酒学酵母遗传群的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的检测步骤，以及如果检测到这样的酵母，则推断该样品包含布鲁塞尔酒香酵母物种的亚硫酸盐/酯抗性酵母。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于分析样品以检测布鲁塞尔酒香酵母物种的亚硫酸盐/酯抗性酵母的存在的方法以及用于实施该方法的试剂盒本专利技术涉及用于分析样品、特别是葡萄酒样品中布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomycesbruxellensis)物种的亚硫酸盐/酯(sulfite)抗性酵母的可能存在的方法，以及用于实施该方法的试剂盒。本专利技术还涉及能够扩增属于酿酒学三倍体(oenologiques)酵母遗传群的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母特异性的核苷酸序列的引物对用于分析样品中布鲁塞尔酒香酵母物种的亚硫酸盐/酯抗性酵母的可能存在的用途。布鲁塞尔酒香酵母(也称为布鲁塞尔德克酵母(Dekkerabruxellensis))物种酵母代表了一类酿造饮料(如葡萄酒、啤酒、苹果酒等)主要的改变来源，并且更特别地是葡萄酒污染的首要原因。这些酵母产生特别大量的挥发性酚类，使葡萄酒具有令人不快的味道和气味，目前用术语“马厩气味”或“马汗”来形容。这种污染可导致重大经济损失，特别是当其影响在木桶中陈化的红葡萄酒时。由布鲁塞尔酒香酵母引起的改变确实影响了差不多25％的红葡萄酒，并导致消费者对葡萄酒的准系统拒绝(rejetquasi-systématique)。负责葡萄酒生产的人员目前采取了多种方法用来对付由布鲁塞尔酒香酵母引起的葡萄酒改变。在这些方法中，可以提到通过软件(例如在Bret’和Brett名下销售的那些)来预测葡萄酒中这些酵母的存在的方法，其根据未发酵葡萄汁和葡萄酒的组成以及葡萄酒制作地应用的酿酒实践来评估给定葡萄酒的污染风险；用于检测这些酵母的存在的定量和半定量方法，尤其是通过在选择性培养基中传播该物种、聚合酶链式反应或流式细胞术，特别地是半定量工具Brett，其允许测定样品中布鲁塞尔酒香酵母群体的水平；或者还有以去除产生的挥发性酚类为目的的补救方法，例如通过吸附剂如酵母片、活性炭等。然而，这些方法中没有一种被证明是真正令人满意的。例如，补救方法一般对经处理葡萄酒具有感官上的影响。另一种目前实施来防止葡萄酒中布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的存在的方法是对抗这些酵母的方法。其中，可以提到过滤、壳聚糖处理等。然而，这些方法具有实施复杂和需要昂贵投资的缺点，并且其往往会对葡萄酒的感官质量产生负面影响。由于对实施的限制较小，用于对抗布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的最广泛的方法是被称为亚硫酸化(sulfitage)的方法，其在于在葡萄酒中加入二氧化硫，以特别地利用硫的抗氧化剂和抗微生物剂性能。然而，当葡萄酒中存在的布鲁塞尔酒香酵母菌株对亚硫酸盐/酯具有抗性时，这种方法被证明是无效的。如Curtin等，2012，在LettersinAppliedMicrobiology，55：56-61出版物中所特别描述的，现有技术确实显示，在布鲁塞尔酒香酵母物种的情况下，亚硫酸盐/酯抗性的表型特征取决于菌株。此外，亚硫酸化方法的实施也被证明具有风险，因为在高剂量下系统地使用二氧化硫促使新的抗亚硫酸盐/酯菌株出现。例如，在前述Curtin等，2012的出版物中报道了在澳大利亚，为了对抗布鲁塞尔酒香酵母而集中使用亚硫酸化约十年之后，目前85％的分离菌是亚硫酸盐/酯抗性的。而且，近年来，一般农业政策的目的是减少投入。在酿酒学中，这导致与越来越多的限制性立法有关的减少使用的亚硫酸盐/酯的剂量的强的社会压力。因此，目前需要这样的方法，其允许理由充分地实施使用亚硫酸盐/酯用于葡萄酒亚硫酸化的策略，即仅针对含有对亚硫酸盐/酯敏感的布鲁塞尔酒香酵母的葡萄酒来使用，对于所述葡萄酒亚硫酸化是有用的。为了提出这样的方法，现有技术已经进行了多种研究以试图建立布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的基因型与其表型特征、更特别地其抵抗磷酸盐/酯的能力之间的关系。例如，前述Curtin等，2012的出版物中所述的研究就是如此，该研究的目的是在许多布鲁塞尔酒香酵母分离菌的基础上鉴定这些酵母的亚硫酸盐/酯抗性表型与基因型标志物之间的潜在关系。然而，到目前为止，就布鲁塞尔酒香酵母而言，还没有研究能够鉴定亚硫酸盐/酯抗性表型特征与基因型特征之间的关系。因此，本专利技术的目的是提出这样的方法，其允许在可能含有布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的样品中、特别是葡萄酒样品中可靠地检测亚硫酸盐/酯抗性酵母的存在，以及任选地，其相对于存在的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的总群的含量，以便能够避免随后亚硫酸化处理后来才知道含有亚硫酸盐/酯抗性酵母并且这样的亚硫酸化处理将被证明无效的葡萄酒。本专利技术的另一个目的在于，该方法的实施简单、快速，而且成本低，并且使用酿酒学分析实验室中目前存在的设备。虽然现有技术的工作指出了亚硫酸盐/酯抗性与酵母基因型之间的相互依赖关系，但是本专利技术人在本专利技术起源时出乎意料地发现，布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的亚硫酸盐/酯抗性与这些酵母的特定基因型无关，而与其倍性有关，即，与这些酵母基因的性质(qualité)无关，而与它们所呈现的染色体的拷贝数有关。更具体地说，本专利技术人发现，在迄今为止所描述的布鲁塞尔酒香酵母物种的三个遗传群，即二倍体群酿酒学三倍体群和啤酒三倍体(debière)群之间，酿酒学三倍体遗传群酵母菌株并且仅有它们对亚硫酸盐/酯具有抗性。因此，在样品中，特别是微生物组成代表了葡萄酒的微生物组成的样品中，属于酿酒学三倍体酵母遗传群的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的存在指示该样品中包含的酵母的亚硫酸盐/酯抗性，而这样的酵母的不存在指示该样品中酵母的亚硫酸盐/酯敏感性。在后一种情况下用亚硫酸盐/酯处理是有利的。在本说明书中，酿酒学三倍体酵母遗传群以常规方式意指底物主要是葡萄酒、特别是红葡萄酒、葡萄汁或葡萄、或藤生长和葡萄酒生产材料的三倍体酵母群。啤酒三倍体酵母遗传群意指底物主要是啤酒以及其他酿造饮料如苹果酒、康普茶、龙舌兰等的三倍体酵母群。Albertin等，2014，在FoodMicrobiology,42:188-195出版物中指出了属于这些群的菌株的实例，指出了每一种的相关底物以及其中保存它们或者其中可能获得它们的保藏中心。因此，根据第一个方面，根据本专利技术提出了分析样品、特别是液体物质(如酿造饮料、特别是葡萄酒)级分或者放置在固体或半固体介质上的样品中抗亚硫酸盐/酯的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的可能存在的分析方法。该方法包括：-检测样品中属于酿酒学三倍体酵母遗传群的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的可能存在的步骤，-以及，如果检测到了属于酿酒学三倍体酵母遗传群的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的这种存在，则推断样品含有亚硫酸盐/酯抗性的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母。相反地，如果未检测到属于酿酒学三倍体酵母遗传群的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的存在，则推断，如果样品含有布鲁塞尔酒香酵母物种酵母，则这些酵母对亚硫酸盐/酯敏感。根据本专利技术，短语“抗亚硫酸盐/酯的酵母”和“亚硫酸盐/酯抗性酵母”是指能够在介质中在对应于酿酒学实践的亚硫酸盐/酯浓度(即0.4mg/L的二氧化硫分子(H2SO3))的存在下生长的酵母。对亚硫酸盐/酯敏感对应于酵母不能在介质中在对应于高于或等于0.4mg/L的量的二氧化硫分子浓度的存在下生长。亚硫酸盐/酯是指存在于给定介质中的二氧化硫的活性分子级分。这种活性级分可特别来源于在介质中(特别是在葡萄汁或葡萄酒中)加入亚硫酸的盐或酯，如亚硫酸酐、亚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于分析样品中布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)物种的亚硫酸盐/酯抗性酵母的可能存在的分析方法，其特征在于，其包括：‑检测所述样品中属于酿酒学三倍体酵母遗传群的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的可能存在的步骤，‑以及，如果检测到这样的存在，则推断所述样品包含抗亚硫酸盐/酯的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.20 FR 15599751.用于分析样品中布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomycesbruxellensis)物种的亚硫酸盐/酯抗性酵母的可能存在的分析方法，其特征在于，其包括：-检测所述样品中属于酿酒学三倍体酵母遗传群的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的可能存在的步骤，-以及，如果检测到这样的存在，则推断所述样品包含抗亚硫酸盐/酯的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母。2.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述检测步骤包括检测所述样品中包含的酵母的酿酒学三倍体酵母遗传群的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母特异性的分子标志物。3.根据权利要求2所述的分析方法，其中所述分子标志物与具有氨基酸序列SEQIDno.1的蛋白质相关。4.根据权利要求2至3中任一项所述的分析方法，其中所述分子标志物由序列SEQIDno.2的核苷酸序列或者与所述序列SEQIDno.2在序列的80％或更多上具有大于或等于90％的同源性程度的任何核苷酸序列的至少90个连续核苷酸的任何区段构成。5.根据权利要求2至4中任一项所述的分析方法，其中所述检测步骤包括：-从所述样品中包含的酵母提取核酸，-通过聚合酶链式反应扩增含有所述分子标志物的基因座，-以及检测如此扩增的DNA中的所述分子标志物。6.根据权利要求5所述的分析方法，其中所述聚合酶链式反应使用序列包含选自序列SEQIDno.3和SEQIDno4的序列的至少一种核苷酸引物。7.根据权利要求2至6中任一项所述的分析方法，其中所述检测步骤包括：-从所述样品中分离布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的菌落，-从这些菌落中的每一个提取核酸，-以及在如此获得的每一种核酸提取物中检测所述分子标志物。8.根据权利要求2至7中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：沃伦·阿尔贝坦，伊莎贝尔·马斯内夫波马雷德，埃米利安·佩尔蒂埃，
申请(专利权)人：波尔多大学，波尔多综合理工学院，波尔多阿基坦科学农业国立高等中学，
类型：发明
国别省市：法国,FR