米卡芬净钠前体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种全新的FR901379转化为FR179642的方法。该方法将交联酶聚体技术应用于FR901379转化为FR179642的过程中。该方法为通过将脱酰酶制备成脱酰酶交联酶聚体，该交联酶聚体将FR901379转化为FR179642。通过该方法，FR901379转化为FR179642的摩尔转化率能达到92％以上，同时简化生产过程，降低了成本。

Preparation of Mikafin net sodium precursor

The invention discloses a completely new method of transforming FR901379 into FR179642. The method is applied to the process of transforming FR901379 into FR179642 by cross-linking enzyme polymerization. The method is to prepare a deacylase crosslinked enzyme polymer by deacylase, which converts FR901379 into FR179642. By this method, the molar conversion rate of FR901379 to FR179642 can reach more than 92%, and the production process is simplified and the cost is reduced.

【技术实现步骤摘要】
米卡芬净钠前体的制备方法
本专利技术涉及微生物发酵领域，具体涉及抗真菌的发酵半合成药物前体的制备，更具体涉及米卡芬净钠前体FR179642的制备方法。
技术介绍
近年来，由于免疫低下患者逐年增多，真菌感染发病率明显升高，尤其是深部真菌感染的发病率和病死率显著增加。棘白菌素类抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物，具有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链，能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，从而达到抗真菌的目的。与传统抗真菌药物相比，该类药物具有作用机制独特，毒副作用低，且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性，是目前临床治疗深部真菌感染的常用药物。FDA已批准上市的这类药物包括卡泊芬净(Caspofungin)、米卡芬净(Micafungin)和阿尼芬净(Anidulafungin)。米卡芬净药用盐为米卡芬净钠。FR901379是合成米卡芬净类药物的重要前体物质，由C.empetri经突变后获得的高产菌株发酵所得。FR901379通过脱酰酶脱除侧链后得到米卡芬净母核FR179642，FR179642经过化学修饰得到米卡芬净钠。FR901379的结构如下：FR179642的结构如下：中国专利91104847.2公开了将FR901379通过菌丝体游动放线菌属utahensisIFO-13244在37℃脱酰基得到FR179642的钠盐。中国专利CN102443050披露了以一种环脂肽化合物为前体通过酶解掉侧链得到FR179642，并报道了该种前体环脂肽化合物的分离提纯方法。此外还有文献中报道由FR179642制备米卡芬净的合成方法(Ueda,S.；Ezaki,M.；Tanaka,M.；etal.StudiesonanovellipopeptideacylasefromStreptomycesspp.forproductionofFR179642,akeyintermediateofantifungallipopeptidedrugFK463.38thIntersciConfAntimicrobAgentsChemother(Sept241998,SanDiego)1998,AbstF-145)。中国专利CN106755221公开了一种FR179642的制备方法，FR179642菌株在培养基中发酵，在发酵过程中分两次添加米卡芬净前体FR901379，并通过多阶段控温的方法，提高FR179642的产量。但长期以来FR179642的发酵一直停留在一个很低的水平，尽管人们都在为寻找一个廉价，高产的培养基而努力，但收效甚微。这就使得FR179642化合物的制备难度加大，成本提高，从而间接使米卡芬净钠长期处于一个较高的价位。因此人们迫切需要一种廉价高效合成FR179642的方法。中国专利CN106544382公开了一种将FR901379转化成FR179642的方法，该方法通过控制转化液中FR901379的起始浓度以及转化过程中温度和pH控制，显著提高了酶的转化效率，转化率可高达83％，但该专利所公开的方法是收集菌体进行转化，转化体系存在大量微生物，转化速度较慢，酶的稳定性差，分离纯化步骤复杂，成本高。华东理工大学硕士学位论文“棘白菌素脱酰酶基因工程菌的构建及应用研究”公开了一种ECB脱酰酶的固定化研究，由于游离的ECB脱酰酶存在储存时间短，回收利用难等缺点，该论文作者对LX-1000HA树脂进行戊二醛交联，将其用于EBC脱酰酶的固定化。通过该方法，虽然转化率较高，但操作复杂，成本较高，固定化过程的化学反应容易导致酶部分失活。基于对扩大生产，降低成本的需要，在米卡芬净的生产领域，仍然需要更优的FR901379转化成FR179642的方法。2000年荷兰Delft理工大学的Cao等在交联酶和交联酶晶体的基础上提出一种新型的固定化酶技术，交联酶聚体(cross-linkedenzymeaggregates，CLEAs)。此通过改变性质使酶分子靠近而形成聚集体从溶剂中沉淀出来，之后将聚集体进行交联，形成交联酶聚体。交联酶聚体是酶本身作为载体的固定化酶，单位体积酶浓度高，稳定、可回收、催化活性高，生产成本低，具有潜在的应用前景。目前报道的交联酶聚体使用的酶包括水解酶、裂合酶、氧化还原酶，目前未见在发酵半合成药物的发酵领域有报道，也未见将此技术应用于脱酰酶的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种全新的FR901379转化为FR179642的方法。该方法将交联酶聚体技术应用于FR901379转化为FR179642的过程中。该方法为通过将脱酰酶制备成脱酰酶交联酶聚体，该交联酶聚体将FR901379转化为FR179642。通过该方法，FR901379转化为FR179642的摩尔转化率能达到92％以上，同时简化生产过程，降低了成本。本专利技术方法包括以下步骤：1)发酵能将棘白菌素B脱酰酶表达在胞外的基因工程菌，获得棘白菌素B脱酰酶粗酶；2)脱酰酶交联酶聚体的制备；3)FR901379和脱酰酶交联酶聚体反应，转化为FR179642。其中，步骤1)中脱酰酶粗酶是由产生菌发酵制得，粗酶产生菌的发酵可使用表达在胞外的基因工程菌株，例如白色链霉菌基因工程菌株(Streptomycesalbus)，(参见“EfficientBioconversionofEchinocandinBtoItsNucleusbyOverexpressionofDeacylaseGenesinDifferentHostStrains[J].ApplEnvironMicrobiol,2013Feb；79(4):1126-33)，采用本领域技术人员熟知的条件进行发酵制备，例如包括但不限于CN102618606中公开的发酵方法。按照上述方法制备得到的脱酰酶发酵液过滤或离心，向上清液加入硫酸铵进行盐析，通入空气，搅拌后静置，过滤或离心，收集沉淀，得到脱酰酶粗酶。其中，所述的硫酸铵的用量为发酵上清液的40～80％(w/v)，优选50％；通入空气的每分钟流量相当于加入硫酸铵后料液总体积的10～30％(v/v)，优选20％；搅拌时间为20～60分钟，优选30分钟；搅拌速度为50～150rpm；静置条件为温度4～15℃、时间8～16小时，优选的静置条件为8℃静置12小时。步骤2)中，脱酰酶交联酶聚体的制备具体方法为：将步骤1)制备得到的脱酰酶粗酶加入磷酸缓冲液后，通入空气，再向上述反应液中加入交联剂聚乙醛，搅拌，以形成脱酰酶交联酶聚体。其中，所述的磷酸缓冲液含磷酸二氢钾2～2.5g/L，磷酸氢二钠1～1.5g/L，pH用盐酸或氢氧化钠调节为5.5～6.5；优选磷酸二氢钾2.24g/L，磷酸氢二钠1.24g/L，pH为6.0。粗酶的加入量为1～3％(w/v)，优选粗酶加入量2％。通入空气的每分钟流量相当于料液体积的10～30％(v/v)，优选20％。所述的聚乙醛加入量为5～10mmol/L，优选5mmol/L；搅拌温度为28～32℃；搅拌速度为50～100rpm，优选50rpm，搅拌时间为2小时。步骤3)中，向上述步骤2)得到的反应液中加入米卡芬净前体FR901379，搅拌，使米卡芬净前体FR901379转化为米卡芬净母核，监测转化体系中米卡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种FR901379转化为FR179642的方法，该方法为FR901379和脱酰酶交联酶聚体反应，转化为FR179642，其中，该交联酶聚体的制备方法为将脱酰酶粗酶与交联剂聚乙醛反应，形成脱酰酶交联酶聚体。

【技术特征摘要】
1.一种FR901379转化为FR179642的方法，该方法为FR901379和脱酰酶交联酶聚体反应，转化为FR179642，其中，该交联酶聚体的制备方法为将脱酰酶粗酶与交联剂聚乙醛反应，形成脱酰酶交联酶聚体。2.如权利要求1所述的交联酶聚体的制备方法为：将脱酰酶粗酶加入磷酸缓冲液后，通入空气，再向上述反应液中加入交联剂聚乙醛，搅拌，以形成脱酰酶交联酶聚体。3.如权利要求2所述的方法，磷酸缓冲液含磷酸二氢钾2～2.5g/L，磷酸氢二钠1～1.5g/L，pH为5.5～6.5，粗酶的加入量为1～3％，通入空气的每分钟流量相当于料液体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁建栋，别一，
申请(专利权)人：博瑞生物医药苏州股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32