一种固态发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种固态发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂的方法，是由以下步骤制得的：一级种子培养；二级培养；压力脉动固态发酵；将发酵物料装至滤袋中，挤压，得发酵液；草酸调节发酵液pH至5.0，截留量为5Kda超滤膜过滤，得浓缩液；草酸调节浓缩液pH至3.0，3500rpm离心取沉淀物，干燥，得鼠李糖脂生物表面活性剂。本发明专利技术具有以下优势：产量高，产物杂质少，能耗低，易操作，后处理简单，污染少，发酵环境均一；惰性多孔材料聚氨酯泡沫性质稳定，持水性强，可重复使用，显著降低生产成本；另外整个发酵过程中无泡沫产生，解决了鼠李糖脂生产过程中起泡严重的技术瓶颈，加快鼠李糖脂生物表面活性剂的产业化进程。

A solid state fermentation method for producing rhamnolipid biosurfactant

The invention discloses a method for producing rhamnolipid biosurfactant by solid-state fermentation, which is prepared by the following steps: first-stage seed culture; second-stage culture; pressure pulsation solid-state fermentation; the fermented material is packed into a filter bag, extruded, and the fermented liquid is obtained; oxalic acid adjusts the pH of the fermented liquid to 5.0, and the rejection is 5Kda ultrafiltration membrane filtration. Concentrate was obtained by filtration, and rhamnolipid biosurfactant was obtained by centrifuging the precipitate with oxalic acid at pH 3.0 and 3500 rpm. The invention has the following advantages: high yield, less impurities in the product, low energy consumption, easy operation, simple post-treatment, less pollution and uniform fermentation environment; inert porous polyurethane foam has stable property, strong water holding capacity, can be reused, and significantly reduces production cost; in addition, no foam is produced in the whole fermentation process, thus solving the problem. Rhamnolipid has become a serious technical bottleneck in the production of rhamnolipid, which accelerates the industrialization of rhamnolipid biosurfactant.

【技术实现步骤摘要】
一种固态发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂的方法
本专利技术属于微生物发酵技术和天然产物的生物合成领域，具体地涉及一种固态发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂的方法。
技术介绍
表面活性剂是一类重要的化工原料，在石油工业、医药农业及精细化工等众多领域占有重要的地位，素有“工业味精”之称。据不完全统计，2016年我国的表面活性剂的产量约为200万吨，并且几乎全是石油基表面活性剂，由此带来的环保问题也变得日益突出。以鼠李糖脂为代表的生物表面活性剂与传统化学合成表面活性剂相比，具有无毒、可再生、易生物降解等优势。同时，要求将可生物降解的表面活性剂作为主要发展对象。可以预见，随着社会的进步和民众环保意识的增强，21世纪的表面活性剂必将朝着安全、温和及易生物降解的方向发展。生物表面活性剂将逐渐成为化学合成表面活性剂的替代品或升级换代品，具有广阔的市场前景。目前，通常采用液态发酵技术进行鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵研究，但是鼠李糖脂的生物合成是严格好氧过程，发酵过程中需要大量通气和不停搅拌，导致起泡逃液严重、发酵过程难以被有效的检测和调控、生产效率低下等问题。这极大限制了鼠李糖脂的生产和应用，阻碍了生物表面活性剂产业的健康发展。为解决此技术瓶颈，人们特地对其泡沫形成机制进行研究，期望通过“厌氧发酵”、“发酵偶联泡沫分离”及“边发酵边消泡”的方式来解决生产过程中起泡的问题，但效果都不理想。因此，如何改进发酵技术解决鼠李糖脂生产过程中起泡严重的问题、提高鼠李糖脂的发酵生产效率，是当前鼠李糖脂发酵研究的热点和主要目标。固态发酵生产鼠李糖脂通常不被研究者采用，其原因是铜绿假单胞菌生产鼠李糖脂是严格好氧过程，一般的固态发酵方法无法提供充足的溶氧。
技术实现思路
本专利技术是提供一种固态发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂的方法。本专利技术采用的技术方案如下：一种固态发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂的方法，是由以下步骤制得的：1）一级种子培养：液体种子培养基在115℃灭菌10-30min，将铜绿假单胞菌菌种接种至液体种子培养基，摇床培养，得一级种子液；2）二级种子培养：将8L液体种子培养基装至15L的机械搅拌式发酵罐中，115℃灭菌20min，冷却至30℃；将一级种子液接种至冷却好的发酵培养基中，培养至种子液长到OD600=12，停止培养，得二级种子液；3）压力脉动固态发酵：将固态发酵培养基按照0.4-0.55的装料系数装至50L压力脉动固态发酵罐中，125℃灭菌30min，冷却至30℃；将二级种子液接种至固态发酵培养基，压力脉动固态发酵培养168h，得发酵物料；装料系数为固相载体的体积与发酵容器的体积比。4）将发酵物料装至滤袋中，挤压，得发酵液；草酸调节发酵液pH至5.0，截留量为5Kda超滤膜过滤，得浓缩液；草酸调节浓缩液pH至3.0，3500rpm离心取沉淀物，干燥，得鼠李糖脂生物表面活性剂。本专利技术制备的鼠李糖脂生物表面活性剂的纯度大于80%。所述步骤1）中，铜绿假单胞菌菌种的接种量为10%；摇床培养的温度为30℃，转速为200rpm，时间为8h。所述的，液体种子培养基的具体组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨4g/L，酵母粉2g/L，氯化钠1g/L，余量为水，初始pH自然。所述步骤2）中，一级种子液的接种量为10%。所述步骤2）中，培养温度为30℃，通气量为2-3L/min，溶氧保持在30%以上，转速为200rpm，培养时间为8-10h。所述步骤3）中，二级种子液的接种量为15%，种子液的体积（v）/液态培养基的体积（v）。所述步骤3）中，固态发酵培养基是由液态培养基和惰性多孔材料聚氨酯泡沫按照12-24：1的质量比制得的。所述液态培养基的具体组成为：氯化钾1g/L，氯化钠1g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾4g/L，七水硫酸镁0.6g/L，硝酸钠3g/L，棕榈油80g/L，余量为水，pH为6.0-6.5。所述步骤3）中，压力脉动固态发酵培养时，通气量为10-15L/min，相对湿度为85-98%，培养温度为30℃，转速为50-70rpm。所述步骤3）中，压力脉动固态发酵培养时，压力脉动周期为15-30min，一个周期内谷压压力为0.05-0.1MPa，谷压维持时间为5-15min；峰压压力为0.15-0.25MPa，峰压维持时间为5-15min。更具体的，发酵过程中根据菌体的生长和产物的生成情况，分时段采取不同的工艺参数如下：1、前期（0-48h）：压力脉动周期为15min，振幅为0.15MPa；谷压压力为0.05MPa，谷压维持时间为5min；峰压压力为0.2MPa，峰压维持时间为10min；通气量为10L/min，相对湿度为98%，转速为50rpm。此阶段菌体基本处于对数期生长阶段，需要大量的空气和营养物质来满足菌体快速生长的需要。此时谷压设定低、峰压设定高、维持时间设定短，可有效保证发酵过程中持续存在高、低压力的高频切换，有利于惰性多孔材料聚氨酯泡沫中液态培养基的流动和空气的传递，加速溶氧和传质的能力，保障菌体的快速生长。2、中期（49-144h）：具体的脉动调控工艺可分为以下两个阶段：2.1、中前期（49-96h）压力脉动周期为25min；振幅为0.1MPa谷压压力为0.1MPa，谷压维持时间为10min；峰压压力为0.2MPa，峰压维持时间为15min；通气量为12L/min，相对湿度为96%，转速为60rpm。2.2、中后期（97-144h）压力脉动周期为30min；振幅为0.1MPa谷压压力为0.1MPa，谷压维持时间为10min；峰压压力为0.2MPa，峰压维持时间为20min；通气量为15L/min，相对湿度为90%，转速为70rpm。此阶段菌体处于生长的稳定期，是鼠李糖脂大量合成阶段，需要综合考虑溶氧、传质及产物促进底物吸收利用等方面进行精细调控。3、后期（145-168h）：压力脉动周期为15min；振幅为0.15MPa谷压压力为0.1MPa，谷压维持时间为5min；峰压压力为0.25MPa，峰压维持时间为10min；通气量为12L/min，相对湿度为85%，转速为60rpm。目的：此阶段培养基营养物质消耗殆尽，菌体生长进入衰亡期，细胞大量死亡、裂解，胞内的鼠李糖脂会被释放，表现为产量小幅增高。此时，再次提高压力脉动的振幅、缩短脉动周期，可有效的保证发酵后期罐内高、低压力的高频切换，有利于菌体裂解和产物的溶出，提高产量。本专利技术所用的铜绿假单胞菌菌种为铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）TIB-R02，该菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏编号CGMCCNo9376。本专利技术的有益效果：1.本专利技术所采用的惰性多孔材料聚氨酯泡沫载体具有疏松、多孔、稳定性好、支撑力强的特点。本专利技术固态发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂具有以下优势：产量高，产物杂质少，能耗低，易操作，后处理简单，污染少，发酵环境均一；惰性多孔材料聚氨酯泡沫性质稳定，持水性强，可重复使用，显著降低生产成本；另外整个发酵过程中无泡沫产生，很好的解决了鼠李糖脂生产过程中起泡严重的技术瓶颈，加快鼠李糖脂生物表面活性剂的产业化进程。2.本专利技术在采用聚氨酯泡沫为载体的基础上结合空本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固态发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂的方法，其特征在于，是由以下步骤制得的：1）一级种子培养：液体种子培养基在115℃灭菌10‑30min，将铜绿假单胞菌菌种接种至液体种子培养基，摇床培养，得一级种子液；2）二级培养：将8L液体种子培养基装至15L的机械搅拌式发酵罐中，115℃灭菌20min，冷却至30℃；将一级种子液接种至冷却好的发酵培养基中，培养至种子液长到OD600=12，停止培养，得二级种子液；3）压力脉动固态发酵：将固态发酵培养基按照0.4‑0.55的装料系数装至50L压力脉动固态发酵罐中，125℃灭菌30min，冷却至30℃；将二级种子液接种至固态发酵培养基，压力脉动固态发酵培养168h，得发酵物料；4）将发酵物料装至滤袋中，挤压，得发酵液；草酸调节发酵液pH至5.0，截留量为5Kda超滤膜过滤，得浓缩液；草酸调节浓缩液pH至3.0，3500rpm离心取沉淀物，干燥，得鼠李糖脂生物表面活性剂。

【技术特征摘要】
1.一种固态发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂的方法，其特征在于，是由以下步骤制得的：1）一级种子培养：液体种子培养基在115℃灭菌10-30min，将铜绿假单胞菌菌种接种至液体种子培养基，摇床培养，得一级种子液；2）二级培养：将8L液体种子培养基装至15L的机械搅拌式发酵罐中，115℃灭菌20min，冷却至30℃；将一级种子液接种至冷却好的发酵培养基中，培养至种子液长到OD600=12，停止培养，得二级种子液；3）压力脉动固态发酵：将固态发酵培养基按照0.4-0.55的装料系数装至50L压力脉动固态发酵罐中，125℃灭菌30min，冷却至30℃；将二级种子液接种至固态发酵培养基，压力脉动固态发酵培养168h，得发酵物料；4）将发酵物料装至滤袋中，挤压，得发酵液；草酸调节发酵液pH至5.0，截留量为5Kda超滤膜过滤，得浓缩液；草酸调节浓缩液pH至3.0，3500rpm离心取沉淀物，干燥，得鼠李糖脂生物表面活性剂。2.根据权利要求1所述固态发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂的方法，其特征在于，所述步骤1）中，铜绿假单胞菌菌种的接种量为10%；摇床培养的温度为30℃，转速为200rpm，时间为8h。3.根据权利要求1所述固态发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂的方法，其特征在于，所述液体种子培养基的具体组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨4g/L，酵母粉2g/L，氯化钠1g/L，余量为水，初始pH自然。4.根据权利要求1所述固态发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂的方法，其特征在于，所述步骤2）中，一级种子液的接种...

【专利技术属性】
技术研发人员：巩志金，杨革，车程川，刘金锋，贺秋红，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37