用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法技术

本发明专利技术涉及用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法。其包括以下步骤：AM真菌与共生植物根系建立共生体；利用荧光染料溶液处理AM真菌根组织，分段后置于载玻片上，并用盖玻片封片；利用激光共聚焦显微镜观察收集图像及进行图像处理。通过本发明专利技术可以灵敏的分析观察和判断AM真菌和其他侵染植物是否建立共生关系，可以作为鉴定AM真菌是否与植物共生的灵敏方法；通过本发明专利技术易于三维立体观察和分析根系菌根丛枝结构的发育；根据观察到的菌根真菌丛枝结构在植物根部的分布情况，可以用本发明专利技术同时研究与丛枝结构对应的植物根细胞质膜的膨大部分，叫做围丛枝膜的生物学功能，如营养物质氮﹑磷输运蛋白基因在膜上表达的比较研究。

【技术实现步骤摘要】
用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法
本专利技术具体涉及用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法。
技术介绍
菌根是植物根系和菌根真菌形成的共生体，自然界中的菌根分为外生菌根和内生菌根。丛枝菌根(ArbuscularMycorrhizal，AM)真菌是自然界中普遍存在的一类内生菌根真菌，地球上约90%的维管束植物都能与其形成丛枝菌根。AM真菌与宿主植物互惠共生：真菌的根外菌丝体（ExtraradicalMycelium,ERM）从土壤中吸收磷、氮素及其它营养元素供给宿主植物，改善了植物对矿质元素的吸收能力，促进植物生长，增强植物的抗逆性等，宿主植物则供给真菌生长所必需的碳水产物。AM真菌的结构主要分为丛枝、菌丝和孢子，除了巨孢囊霉属和盾孢囊霉属以外大多数AM真菌还具有泡囊结构。丛枝是AM真菌繁殖体侵染植物根的根内菌丝，菌丝在皮层细胞内不断分叉分枝形成的枝状结构（arbuscule）；与之对应的是植物根细胞质膜的膨大部分，叫做围丛枝膜（PAM，periarbuscularmembrane）。围丛枝膜以及与丛枝结构包围的间隙叫做围丛枝空间（PAS，periarbuscularspace），围丛枝空间PAS是真菌与植物共生体进行营养与信息交换的主要场所。随着AM真菌丛枝结构的形成，根部皮层细胞发生巨大变化，这需要重新组织细胞质膜，包括细胞骨架和细胞器的重构，尤其是膜面积的巨大增加。其中有些细胞的改变已经用以前传统的抗体和荧光蛋白融合标记技术检测，但是这些菌根侵染细胞仍有很多生物学方面的功能是目前传统技术研究不清楚的。此外，由于传统的光学显微镜只能观察染色后的丛枝状结构，而且只能是一个平面上的物像，所以不能全面观察了解丛枝状结构，影响了对其生物功能的进一步研究和了解。于是迫切需要一种能够三维立体、多角度观察的显微方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法的技术方案。所述的用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法，其特征在于包括以下步骤：1）AM真菌与共生植物根系建立共生体；2）利用荧光染料WGA-Alexafluor488溶液处理AM真菌根组织，分段后置于载玻片上，并用盖玻片封片；3）利用激光共聚焦显微镜观察收集图像及进行图像处理。所述的用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法，其特征在于所述的步骤1）具体为：将生根3个星期的共生植物，从MS琼脂培养基中取出，转移到含有MS培养基的培养皿上，同时接种上与胡萝卜根侵染的丛枝菌根真菌孢子或菌丝，进行共生培养。所述的用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法，其特征在于所述的步骤2）具体为：a、将步骤1）得到的AM真菌侵染的植物根浸泡于50%乙醇1小时；b、用水清洗后，放入20%KOH溶液中90℃保温2小时，再分别用蒸馏水和PBS缓冲溶液洗涤；c、将洗涤后的AM真菌侵染的植物根培养在含有浓度为5ug/ml的WGA-Alexafluor488溶液的培养皿中过夜；d、把含有WGA-Alexafluor488的根切成4毫米长的片段，再把4毫米根段组织放置于厚度在0.8～1.2mm之间载玻片上，用厚度在0.17mm盖玻片封片。所述的用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法，其特征在于所述的步骤3）具体为：根片段用LeicaTCS-SP5共聚焦显微镜用20倍或63倍水浸式目镜观察成像，同时根据荧光收集不同干扰比对图像DIC，激光488nm，photocounting610，扫描时间35.18秒，PixelDwell38.49秒,Pixelsize0.21um，Framemode，扫描区域图像大小139.3×104.6um，光学截图用0.08um间隔收集并叠加，图像用LeicaLAS-AF软件2.6.0处理。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术利用MS培养基将共生植物和丛枝菌根真菌建立共生体，方便有效；2.通过本专利技术可以灵敏的分析观察和判断AM真菌和其他侵染植物是否建立共生关系，可以作为鉴定AM真菌是否与植物共生的灵敏方法；3.通过本专利技术易于三维立体观察和分析根系菌根丛枝结构的发育（图2）；4.根据观察到的菌根真菌丛枝结构在植物根部的分布情况，可以用本专利技术同时研究与丛枝结构对应的植物根细胞质膜的膨大部分，叫做围丛枝膜（PAM，periarbuscularmembrane）的生物学功能，如营养物质氮﹑磷输运蛋白基因在膜上表达的比较研究。附图说明图1为用传统光学显微镜观察得到的杨树根和丛枝菌根真菌共生关系图，图1A中为杨树根和丛枝菌根真菌Rhizophagusirregularis建立共生关系；图1B为用次甲基蓝染色后观察的杨树根和丛枝菌根真菌R.irregularis丛枝结构。图2为通过本专利技术观察得到的寄主植物杨树(Populustrichocarpa）和AM真菌R.irregularis共生建立的丛枝结构。具体实施方式以下结合实施例来进一步说明本专利技术。实施例11、所需材料：植物用杨树(P.trichocarpa)体外克隆植物，丛枝菌根真菌用R.irregularis。2、实验材料，Confocal专用小培养皿或其它小圆形培养皿。3、MS培养基的制备；每升培养基中宏量元素50毫升，微量元素100毫升，葡萄糖1克，维生素10毫升。混合这些元素，调节pH至5.5，加琼脂粉10克，灭菌121°C，20分钟。冷却后，倒入培养皿，备用。4、杨树根与丛枝菌根真菌R.irregularis建立共生体将生根3个星期的杨树，从MS琼脂培养基中将它们取出时要小心以避免带有琼脂，转移到MS培养基上，同时接种上与RiT-DNA转化的carrotroot侵染的丛枝菌根真菌R.irregularis孢子或菌丝，有利于与杨树根建立共生体。待共培养3个月后，用镊子挑取杨树根，去除和洗涤根部琼脂，以待下一部操作。5、利用染料WGA-Alexafluor488处理AM真菌菌根组织为了观察丛枝显微结构，先把AM真菌侵染的根浸泡于50%乙醇1小时，接着用水清洗后，放入20%KOH溶液90℃保温2小时，而后用蒸馏水洗涤5次，洗过的根用PBS缓冲溶液洗涤，再放置培养在Confocal专用小培养皿且含有WGA-Alexafluor488溶液中过夜。而后，为了用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察丛枝状结构，把含有WGA-Alexafluor488的根切成4毫米长的片段。最后，把4毫米根段组织放置于厚度在0.8～1.2mm之间载玻片上，用厚度在0.17mm盖玻片封片。6、利用激光共聚焦显微镜观察收集图像及进行图像处理将根片段用LeicaTCS-SP5共聚焦显微镜用20倍或63倍水浸式目镜观察成像。同时根据荧光收集不同干扰比对图像（DIC），激光488nm，photocounting610(gain)，扫描时间35.18秒，PixelDwell38.49秒,Pixelsize0.21um.Framemode，扫描区域图像大小139.3×104.6um.光学截图用0.08um间隔收集并叠加。图像用LeicaLAS-AF软件2.6.0处理。观察结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法，其特征在于包括以下步骤：1）AM真菌与共生植物根系建立共生体；2）利用荧光染料WGA‑Alexa fluor488 溶液处理AM真菌根组织，分段后置于载玻片上，并用盖玻片封片；3）利用激光共聚焦显微镜观察收集图像及进行图像处理。

【技术特征摘要】
1.用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法，其特征在于包括以下步骤：1）AM真菌与共生植物根系建立共生体；2）利用荧光染料WGA-Alexafluor488溶液处理AM真菌根组织，分段后置于载玻片上，并用盖玻片封片；3）利用激光共聚焦显微镜观察收集图像及进行图像处理。2.如权利要求1所述的用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法，其特征在于所述的步骤1）具体为：将生根3个星期的共生植物，从MS琼脂培养基中取出，转移到含有MS培养基的培养皿上，同时接种上与胡萝卜根侵染的丛枝菌根真菌孢子或菌丝，进行共生培养。3.如权利要求1所述的用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法，其特征在于所述的步骤2）具体为：a、将步骤1）得到的AM真菌侵染的植物根浸泡于50%乙醇1小时；b、用水清洗后，放入20%KOH溶液中90℃保温2小时，再分别用蒸馏水和PBS缓冲溶液洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：金海如，蒋湘艳，
申请(专利权)人：浙江师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33