本发明专利技术公开了一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒及方法。本发明专利技术提供的该试剂盒包括如SEQ ID NO.1～3所示的引物和探针。本发明专利技术提供的方法能在40分钟内完成标本中GBS的检测，检测快速准确；操作步骤较少，整个过程无需特殊的仪器设备，且结果直接肉眼观察，实验操作简捷。
【技术实现步骤摘要】
基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒及方法
本专利技术涉及一种无乳链球菌的检测试剂盒，特别涉及一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒及方法。
技术介绍
无乳链球菌(Streptococcusagalactiae，groupBstreptococcus，GBS)属于链球菌属B血清群，为一种常见的有荚膜的革兰氏阳性致病菌。GBS是围生期女性泌尿生殖道感染和新生儿感染的常见病原菌，具有发病率高和病死率高的特点。GBS寄生在母体生殖道，分娩时可导致新生儿携带该菌，是引发以产褥期脓毒症、肺炎和脑膜炎为特征的新生儿感染的重要致病菌之一；同时，孕妇GBS感染易发生胎膜早破、绒毛羊膜炎、子宫内膜炎和尿道感染等疾病。20世纪70年代以来，GBS所致的妇女生殖道感染，尤其是在围产期感染呈上升趋势。90年代以来，在发达国家GBS感染是新生儿间接死因的第一位，而发展中国家感染正在上升。对GBS的诊断主要是通过对孕产妇直肠或阴道拭子、新生儿的血液或脑脊液进行细菌培养来实现，但在检测孕妇GBS发现此菌普通培养对营养要求较高，培养鉴定耗时较长(至少2d)且阳性率较低。近年来，国内外已有运用血清学检测方法检测血清中的GBS特异性抗原及对GBS感染菌株进行血清型分型，方法有乳胶凝集实验(LA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，协同凝集试验(CoA)及对流免疫电泳(CIE)等。这些方法的特异性约为95％左右，但敏感性从19％到82％不等。即使选用不同试剂盒，这种方法在孕妇定植中检出率仅为4％-37％。1997年，美国食品和药品管理局(FDA)发出这类方法假阴性率和假阳性率均很高的可信度警告。另外，血清学方法包括酶免疫分析，CIE以及抑制性酶联免疫分析等也可对GBS分型，但均需要高滴度的抗血清或昂贵的试剂盒，限制了应用。由于传统的培养和血清学检测方法存在检测耗时长、检测灵敏度和阳性率低及检测成本昂贵等问题，再加上GBS的抗生素预防策略的实施以及抗生素的广泛应用，对轻度感染和经抗生素治疗的患者，传统的培养和血清学检测方法出现很高的假阴性率和假阳性率发生。PCR技术的发展，为检测各种临床标本中的病原菌提供了快速、敏感、特异的有力的工具，近年来在检测GBS感染方面也得到了广泛的应用。但是，人们仍在在研究更为快速、更为灵敏、更为简便、不依赖于精密仪器的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，包括引物GBS-F-1、引物GBS-R-1和探针GBS-P-1；引物GBS-F-1：5’-CTCTAGTAAAGCGTGTATTCCAGATTTCCTTATC-3’；引物GBS-R-1：5’-BIOTIN-CTATTGGTAGTCGTGTAGAAGCCTTAACAGATG-3’；探针GBS-P-1：5’-FAM-CAACTGAAGCAAATGGATCTAAAATGCGAAT/IDSP(DSPACER)/ACCAGCTTAGTTATCCC-C3SPACER-3’。所述的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒还包括用于RPA扩增的nfo试剂、用于RPA扩增的水、试纸条和试纸条检测缓冲液中的至少一种。所述的用于RPA扩增的nfo试剂包括nfo干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液和乙酸镁中的至少一种。所述的nfo干粉试剂中包含用于RPA扩增的酶。所述的用于RPA扩增的酶为能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种。所述的试纸条为侧流层析试纸条。所述的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒包含预混液，预混液中的主要成分为引物GBS-F-1、引物GBS-R-1和探针GBS-P-1。所述的预混液中各成分的浓度以最终使用时各成分的终浓度如下计算：引物GBS-F-10.42μM，引物GBS-R-10.42μM，探针GBS-P-10.12μM。所述的用于RPA扩增的水优选为双蒸水或超纯水。一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测方法，应用上述试剂盒实现，包括如下步骤：(1)对待检测样本提取基因组DNA；(2)配制RPA扩增反应体系；每50μl反应体系的组成如下：1管nfo干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液29.5μl、浓度为10μM的引物GBS-F-1和GBS-R-1各2.1μl、浓度为10μM的探针GBS-P-10.6μl、基因组DNA2μl，用于RPA扩增的水补足至47.5μl；(3)加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μl，立即进行RPA扩增，37℃反应25min；(4)试纸条检测：取5μlRPA扩增产物，加入100μl试纸条检测缓冲液，混匀后插入试纸条反应5-15min，最后判读结果；(5)结果判读：每批次实验必须同时做阳性对照、阴性对照和空白对照，三种对照完全符合后才能确认结果的可靠性；①若只是试纸条的Control条带显色，检测结果为阴性；②若试纸条的Control条带和检测条带同时显色，检测结果为阳性。步骤(1)中所述的标本包括泌尿生殖道分泌物棉拭子。所述的检测方法可在非诊断目的领域中进行应用，如实验研究领域中。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术通过引物和探针的设计、优化，采用RPA等温扩增技术，对无乳链球菌的检测时间快速，灵敏度高，不需要特殊仪器设备；(2)本专利技术的检测结果采用试纸条显色的方法，操作简便快捷。附图说明图1是GBSRPA在不同温度下的扩增效果图；其中，泳道BC为空白对照，泳道M为100bpDNAMarker。图2是GBSRPA在不同时间下的扩增效果图；其中，泳道BC为空白对照，泳道M为100bpDNAMarker。图3是GBSRPA扩增特异性的检测结果图；其中，泳道1为B型链球菌、泳道2为德氏乳杆菌、泳道3为乳酸乳球菌、泳道4为淋病奈瑟菌、泳道5为厌氧消化链球菌、泳道6为奇异变形杆菌、泳道7为加德纳氏菌、泳道8为鲍曼不动杆菌、泳道9为脆弱拟杆菌、泳道10为短双歧杆菌、泳道11为柯氏动弯杆菌、泳道12为阴道毛滴虫、泳道13为解脲脲原体、泳道14为沙眼衣原体、泳道15为白色念珠菌、泳道16为A型链球菌、泳道17为肺炎链球菌、泳道18为金黄色葡萄球菌、泳道19为粪肠球菌、泳道BC为空白对照、泳道M为100bpDNAMarker。图4是GBSRPA扩增灵敏性的检测结果图；其中，图A是琼脂糖凝胶检测结果图，图B是试纸条检测结果图；图B中1-6分别对应的DNA拷贝数为：101、102、103、104、105和106。图5是本专利技术的检测结果图；其中，1-3为临床GBS阳性棉拭子标本，4-6为临床GBS阴性棉拭子，7为空白对照。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1本专利技术建立了一种基于重组酶聚合酶扩增技术可视化的无乳链球菌(GBS)核酸检测方法。本专利技术利用RPA等温扩增技术结合免疫层析技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：包括如SEQ ID NO.1所示的引物GBS‑F‑1、如SEQ ID NO.2所示的引物GBS‑R‑1和如SEQ ID NO.3所示的探针GBS‑P‑1。
【技术特征摘要】
1.一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：包括如SEQIDNO.1所示的引物GBS-F-1、如SEQIDNO.2所示的引物GBS-R-1和如SEQIDNO.3所示的探针GBS-P-1。2.根据权利要求1所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括用于RPA扩增的nfo试剂、用于RPA扩增的水、试纸条和试纸条检测缓冲液中的至少一种。3.根据权利要求2所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的用于RPA扩增的nfo试剂包括nfo干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液和乙酸镁中的至少一种。4.根据权利要求2所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的用于RPA扩增的水为双蒸水或超纯水。5.根据权利要求2所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的试纸条为测流层析试纸条。6.根据权利要求1所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒包含预混液，预混液中的成分包含引物GBS-F-1、引物GBS-R-1和探针GBS-P-1。7.根据权利要求6所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的预混...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟华敏，胡思琪，关小珊，邓秋连，钟玉葵，谢永强，周珍文，
申请(专利权)人：广州市妇女儿童医疗中心，
类型：发明
国别省市：广东,44
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