糖转运蛋白修饰的酵母菌株和用于生物制品生产的方法技术

描述了具有能够转运诸如麦芽酮糖的非葡萄糖的糖的异源糖转运蛋白的遗传修饰的酵母。所述异源糖转运蛋白可以是根据SEQ ID NO:44或与SEQ ID NO:44具有相似性的蛋白质。还描述了其中所述酵母能够消耗所述非葡萄糖的糖的使用酶处理的淀粉的发酵方法。所述工程改造的酵母可用于生产期望的生物制品，诸如高乙醇，其中在培养基中具有少量残余糖。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】糖转运蛋白修饰的酵母菌株和用于生物制品生产的方法相关申请的交叉引用本申请要求2015年12月17日提交的美国临时专利申请号62/268,932的优先权，所述专利申请据此以引用的方式整体并入。序列表在2016年12月16日创建，并且具有270千字节大小的标题为“N00309_Sequence_Listing.txt”的ASCII文本文件的全部内容以引用方式并入本文。专利
本专利技术涉及能够消耗麦芽酮糖的遗传修饰的酵母、具有异源糖转运蛋白的遗传修饰的酵母以及用于使用遗传修饰的酵母生产乙醇的方法。背景通过发酵生产乙醇是熟知的工业过程。然而提高乙醇产量在技术上可能是困难的。存在各种因素使微生物在为提高乙醇产量而设计的发酵条件下生长具有挑战性。例如，发酵培养基可具有增加的底物浓度以促进乙醇生产，但这些条件可能对细胞生长具有负面影响。而且，增加的乙醇浓度和不期望的副产物的积聚可能对细胞健康不利。已选择了酵母菌株耐受这些条件，其可导致乙醇产量的提高。具体地，酵母酿酒酵母的乙醇耐受性菌株已在工业环境中用作生产乙醇的主力微生物。发酵培养基的组分可能对乙醇生产具有重大影响。在发酵过程中，碳水化合物或碳水化合物混合物存在于培养基中。淀粉是一种广泛可得的且便宜的碳水化合物来源，并且可从各种植物来源(诸如玉米、小麦、大米、大麦等)获得。许多用于发酵的生物体不能直接代谢淀粉，或者缓慢且低效地代谢淀粉。因此，常见的是在将淀粉供给于发酵过程中之前对其进行处理，以便将其分解成生物体可容易地发酵的单糖。通常，淀粉被水解以形成含有葡萄糖(右旋糖)的淀粉水解产物的混合物，所述葡萄糖是主要的单体糖，并且是发酵生物体优选的。淀粉水解通常使用强酸进行，并且将产生包含淀粉降解产物的组合物。然后可用碱中和组合物以提高pH。由于使用酸将淀粉完全水解成葡萄糖可能是困难且昂贵的，因此经常不运行到完成，从而产生部分水解的淀粉组合物。然后经常通过加入α-淀粉酶来处理部分水解的淀粉组合物，所述α-淀粉酶可裂解淀粉分子内部区域中的1,4-键，从而导致组合物的粘度降低。然而，即使用α-淀粉酶处理后，仍然存在一些糖低聚物。如此，可进一步用葡糖淀粉酶处理酸和α-淀粉酶处理的淀粉组合物以促进这些糖低聚物的降解。化学和酶促处理淀粉组合物以制备发酵原料的步骤可导致形成低分子量的发酵不良的糖。例如，在遵循酸处理和然后中和组合物的条件下，可能发生低分子量糖产物的异构化。这些异构化可能导致形成诸如某些二糖的产物，这些产物不能被酵母很好地利用，或者难以转化为有用的产物。而且，葡糖淀粉酶的存在可能有助于产生低聚糖，所述低聚糖由葡糖淀粉酶将葡萄糖逆转化为葡萄糖低聚物而产生。在发酵期间，此类产物可在发酵培养基中积累并且可能损害发酵过程。专利技术概要本专利技术涉及发酵方法、工程改造的酵母和生物制品(诸如乙醇)的生产。本专利技术的方法使用包含淀粉产品(诸如部分水解的淀粉)的发酵培养基，所述淀粉产品包含一种或多种低聚糖(诸如麦芽酮糖、异麦芽糖和/或潘糖)。低聚糖可在中性pH下在部分水解的淀粉组合物中形成，或者其包含葡糖淀粉酶以形成可发酵的碳水化合物组合物。本专利技术的工程改造的酵母包含异源糖转运蛋白，并且能够在发酵过程期间使碳水化合物组合物发酵，同时使低聚糖的积聚最小化。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种发酵方法，其包括以下步骤：(a)提供一种发酵培养基，其包含含有麦芽酮糖的水解淀粉组合物和含有异源二或三吡喃葡糖基糖转运蛋白的工程改造的酵母，其中在第一时间点，麦芽酮糖以0.5g/L或更大的第一浓度存在；以及(b)在一段时间内将碳水化合物组合物发酵至第二时间点，在此第二时间点麦芽酮糖处于第二浓度。麦芽酮糖的第二浓度小于使用确实具有异源糖转运蛋白但在其他方面与工程改造的酵母相同的酵母并且在相同的发酵条件下获得的麦芽糖的浓度。本专利技术的工程改造的酵母的益处可理解为其在使用麦芽酮糖作为主要碳源的培养基中生长的能力。因此，在另一方面，本专利技术提供了一种包含异源糖转运蛋白的遗传修饰的酵母，其中所述酵母能够以0.02或更大的速率在改性的标准酵母培养基上生长，并且在标准条件下生长，所述改性的标准酵母培养基包含含有浓度为至少97％(重量)的麦芽酮糖的碳水化合物组合物。在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种遗传修饰的Crabtree阳性酵母，其包含与SEQIDNO:44具有90％或更大同一性的异源多肽(其是二或三吡喃葡糖基糖转运蛋白)。除异源糖转运蛋白之外，工程改造的酵母还可包含其他遗传修饰，诸如增加α-葡萄糖解糖酶(例如，细胞内异麦芽糖酶)活性的遗传修饰，和/或异源淀粉降解多肽(诸如葡糖淀粉酶)。在实施方案中，将工程改造的酵母在用于生产乙醇的发酵方法(诸如其中乙醇在发酵培养基中以80g/L至140g/L范围内的浓度生产)中使用。当用于发酵已用淀粉分解酶(诸如葡糖淀粉酶)处理的部分水解的淀粉组合物时，本专利技术的方法和工程改造的细胞可提供特别的益处。已发现低分子量的非葡萄糖的糖(诸如麦芽酮糖、异麦芽糖和潘糖)在酶处理的淀粉产品组合物中大量形成。低分子量糖(例如，麦芽酮糖等)随着DE的增加而增加。这些糖还可在具有中性pH的水解淀粉组合物中形成。已发现这些类型的糖在发酵培养基中特别是在发酵的后期不是期望的组分。这些低分子量糖不仅通过妨碍发酵，还通过与发酵产物反应而干扰产物产量。虽然可向淀粉水解产物中加入酶以将非葡萄糖的糖转化为葡萄糖，但已发现向具有高葡萄糖浓度的淀粉水解产物材料中加入这种酶往往会使所述酶不太有效。本专利技术提供了一种在发酵期间有效利用这些低分子量非葡萄糖的糖(诸如麦芽酮糖)的稳健方法。本专利技术的工程改造的生物体可消耗存在于发酵液中的这些非葡萄糖的糖，并且防止其积聚，否则所述积聚将损害发酵过程的各个方面。此外，工程改造的细胞还可包含一种或多种遗传修饰，所述遗传修饰提供一旦转运到细胞中便促进非葡萄糖的糖转化为葡萄糖的酶。在一个方面，本公开提供了一种发酵方法，其包括：用包含葡糖淀粉酶(GA)表达基因的遗传工程改造的酵母发酵包含葡萄糖低聚物的液体培养基，其中发酵中产生的乙醇的量在接种后36小时或更长时间为至少80g/L，发酵期间培养基的葡萄糖浓度不超过70g/L，并且与使用酵母且在接种10小时或更短时间内具有超过80g/L的葡萄糖浓度的发酵过程相比，发酵期间产生的乙醛总量减少。在一些实施方案中，遗传工程改造的酵母是本文所述的任何酵母。在一些实施方案中，发酵期间培养基的葡萄糖浓度不超过80、75、70、65、60、55、50、45或40g/L，并且与使用酵母且具有超过80、95、90、95、100或105g/L的葡萄糖浓度的发酵过程相比，发酵期间产生的乙醛总量减少。在一些实施方案中，培养基的右旋糖当量(DE)在接种5小时或更短时间内小于20、25、30、35、40、45或50。在一些实施方案中，在接种后36小时或更长时间，发酵中产生的乙醇的量为至少85、90、95、100或105g/L。在一些实施方案中，在发酵期间培养基的葡萄糖浓度不超过75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25或20g/L。在一些实施方案中，与其中GA活性是1XGA活性的至少0.8倍的过程相比，发酵期间产生的乙醛的总量减少。在一些实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵方法，其包括：提供一种发酵培养基，所述发酵培养基包含含有麦芽酮糖的水解淀粉组合物和含有异源二或三吡喃葡糖基糖转运蛋白的工程改造的酵母，其中在第一时间点，麦芽酮糖以0.5g/L或更大的第一浓度存在；以及在一段时间内使所述培养基中的可发酵碳水化合物组合物发酵至第二时间点，其中麦芽酮糖以第二浓度存在于所述培养基中，并且所述第二浓度小于使用不具有所述异源糖转运蛋白的在其它方面相同的酵母在相同发酵条件下在所述第二时间点获得的麦芽酮糖的浓度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.17 US 62/268,9321.一种发酵方法，其包括：提供一种发酵培养基，所述发酵培养基包含含有麦芽酮糖的水解淀粉组合物和含有异源二或三吡喃葡糖基糖转运蛋白的工程改造的酵母，其中在第一时间点，麦芽酮糖以0.5g/L或更大的第一浓度存在；以及在一段时间内使所述培养基中的可发酵碳水化合物组合物发酵至第二时间点，其中麦芽酮糖以第二浓度存在于所述培养基中，并且所述第二浓度小于使用不具有所述异源糖转运蛋白的在其它方面相同的酵母在相同发酵条件下在所述第二时间点获得的麦芽酮糖的浓度。2.如权利要求1所述的发酵方法，其中所述工程改造的酵母能够以大于0.02的速率在所述培养基中生长。3.如权利要求1或2所述的发酵方法，其中所述麦芽酮糖在所述第一时间点以0.5g/L至5g/L范围内的浓度存在于所述培养基中。4.如权利要求1-3中任一项所述的发酵方法，其中在所述第一时间点(a)异麦芽糖以至少0.5g/L的浓度存在于所述液体培养基中，(b)潘糖以至少0.5g/L的浓度存在于所述液体培养基中，或(a)和(b)两者。5.如前述权利要求中任一项所述的发酵方法，其中所述遗传修饰的酵母由不具有糖转运蛋白的酵母或由不具有在麦芽酮糖上生长的能力的酵母制备，所述糖转运蛋白与功能性异麦芽糖转运蛋白ScMAL11(SEQIDNO:7)具有90％或更大同一性。6.如前述权利要求中任一项所述的发酵方法，其中所述遗传修饰的酵母是酿酒酵母。7.如前述权利要求中任一项所述的发酵方法，其中所述遗传修饰的酵母包含与SEQIDNO:44具有90％或更大同一性的异源多肽。8.如前述权利要求中任一项所述的发酵方法，其中在所述第一时间点异麦芽糖的量在所述可发酵碳水化合物的0.25％-5％(重量)范围内。9.如权利要求8所述的发酵方法，其中在所述第一时间点异麦芽糖的量在所述可发酵碳水化合物的0.5％–1.5％(重量)范围内。10.如前述权利要求中任一项所述的发酵方法，其中在所述第二时间点的麦芽酮糖浓度不超过在所述第一时间点的浓度的四倍。11.如权利要求11所述的发酵方法，其中在所述第二时间点的麦芽酮糖浓度不超过在所述第一时间点的浓度的两倍。12.如权利要求1所述的发酵方法，其中在所述第二时间点的麦芽酮糖浓度不超过1g/L。13.如前述权利要求中任一项所述的发酵方法，其中所述遗传修饰的酵母产生生物制品。14.如权利要求13所述的发酵方法，其中所述生物制品为乙醇。15.如权利要求14所述的发酵方法，其在所述第二时间点在所述液体培养基中提供80g/L或更大的乙醇浓度。16.如权利要求15所述的发酵方法，其在所述第二时间点在所述液体培养基中提供80–140g/L范围内的乙醇浓度。17.如前述权利要求中任一项所述的发酵方法，其中遗传修饰的酵母还包含以高于未修饰酵母的水平表达的异源异麦芽糖酶或内源异麦芽糖酶。18.如权利要求17所述的发酵方法，其中所述内源异麦芽糖酶是酿酒酵母异麦芽糖酶。19.如权利要求18所述的发酵方法，其中所述内源异麦芽糖酶选自由IMA1、IMA2、IMA3、IMA4和IMA5组成的组。20.如权利要求18或19所述的发酵方法，其中所述内源异麦芽糖酶处于异源启动子的控制下，在所述工程改造的酵母中以多个拷贝存在，或两者兼有。21.如前述权利要求中任一项所述的发酵方法，其中所述遗传修饰的酵母还包含异源淀粉降解酶。22.如权利要求21所述的发酵方法，其中异源淀粉降解酶是葡糖淀粉酶。23.如权利要求22所述的发酵方法，其中所述异源葡糖淀粉酶为选自由以下项组成的组的葡糖淀粉酶：扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、里氏木霉葡糖淀粉酶、瓣环栓菌葡糖淀粉酶、草酸青霉葡糖淀粉酶、米根霉葡糖淀粉酶、泡盛曲霉葡糖淀粉酶和埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。24.如权利要求22所述的发酵方法，其中所述异源葡糖淀粉酶与SEQIDNO:45(SfGlm)具有90％或更大的序列同一性。25.如权利要求22所述的发酵方法，其中所述异源葡糖淀粉酶包含异源分泌序列。26.一种发酵方法，其包括：使用包含与SEQIDNO:44具有90％或更大同一性的异源多肽的遗传修饰的酵母发酵包含可发酵碳水化合物组合物的液体培养基，所述可发酵碳水化合物组合物以0.5g/L可发酵碳水化合物或更大的量包含麦芽酮糖、异麦芽糖和/或潘糖中的一种或多种。27.一种包含异源二或三吡喃葡糖基糖转运蛋白的遗传修饰的酵母，其中在标准条件下生长的所述酵母能够在包含碳水化合物组合物的合成培养基上以0.02或更大的速率生长，其中所述碳水化合物组合物中的麦芽酮糖以至少97％(重量)的量存在。28.一种遗传修饰的Crabtree阳性酵母，其包含与SEQIDNO:44具有90％或更大同一性的异源多肽。29.如权利要求28所述的遗传修饰的酵母，其中所述多肽与SEQIDNO:44具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大同一性。30.如权利要求29所述的遗传修饰的酵母，其包含SEQIDNO:44。31.如权利要求28-30中任一项所述的遗传修饰的酵母，其是酵母属的种。32.如权利要求31所述的遗传修饰的酵母，其是酿酒酵母。33.如权利要求27-32中任一项所述的遗传修饰的酵母，其由不具有糖转运蛋白的酵母或由不具有在麦芽酮糖上生长的能力的酵母制备，所述糖转运蛋白与功能性异麦芽糖转运蛋白ScMAL11(SEQIDNO:7)具有90％或更大同一性。34.如权利要求27...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·米勒，A·内格雷特雷蒙德，J·维尔多豪斯，A·瓦什，B·拉什，
申请(专利权)人：嘉吉公司，
类型：发明
国别省市：美国,US