一种基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法技术

一种基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法，其方法特征是将待测化合物与表达有药物靶点的细胞充分孵育，通过重复三次洗脱、孵育、离心步骤，不断移除从药物靶点解离的待测化合物，随后使用细胞功能实验，检测经洗脱后，未从药物作用靶点解离的化合物所产生功效，所得结果与同等浓度的待测化合物和表达有药物靶点的细胞充分孵育后，未经洗脱、孵育、离心步骤，所产生的功效进行对比，分析所测化合物停留时间的长短。该细胞洗脱实验方法具有无污染，高通量，操作简单等特点。

A cell elution method based on residence time of drug target

A cell elution method based on the residence time of drug targets is described. The method is characterized by incubating the compounds to be tested and the cells expressing the drug targets adequately. The compounds to be eluted from the drug targets are continuously removed by repeated three steps of elution, incubation and centrifugation. Then the elution is detected by cell function test. The results were compared with those obtained by incubating the same concentration of the compounds and cells expressing the drug targets without elution, incubation and centrifugation, and the residence time of the compounds was analyzed. The cell elution experiment method is characterized by no pollution, high throughput and simple operation.

【技术实现步骤摘要】
一种基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法
本专利技术涉及一种细胞洗脱方法，尤其是涉及一种基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法。
技术介绍
药物靶点停留时间是一项近年来新兴的药理学概念。此项分子结合动力学指标反映了药物与其作用靶点结合后，两者形成复合体的存在时间。测定药物与靶点结合的分子动力学特征，在早期的药物设计与筛选过程中具有重要的意义。已有研究结果显示，优化药物在作用靶点上的停留时间，能够改善药物的临床药效，减少药物的副作用。因此，开展基于药物靶点停留时间的先导化合物筛选与优化，可能为创新药物的设计与发现提供新的依据，而建立快速、有效，基于药物靶点停留时间的筛选方法，能为先导药物的设计与优化提供新的手段。目前，国内外对于药物靶点停留时间的研究，已经取得了一定的进展，包括一系列检测方法的建立，这其中包括对待测化合物进行放射性同位素标记后，利用放射性同位素配体结合速率实验和离解速率实验，测量其在药物靶点上的结合速率和离解速率，从而得到其靶点停留时间；或者将未标记的待测化合物与放射性同位素标记的标准物和药物靶点共同孵育，进行竞争结合，利用竞争结合模型计算待测化合物停留时间。然而，这些方法存在着一定的局限性。首先，现有的方法需要使用放射性同位素标记的化合物，要求开展相关实验的场地和操作人员具有相应的资质，因此限制了此方法开展的广泛性。其次，使用上述方法对化合物进行分子动力学检测，需要通过测定一系列时间点下的数值，计算药物靶点停留时间，这样并不便于对一系列未知的化合物进行快速、高通量的筛选。因此，在早期的药物研究与筛选过程中，迫切的需要在筛选方法上进行更新。专利技术内容为了克服现有检测方法操作不便、筛选通量低，以及对放射性同位素标记配体的依赖等问题，本专利技术提供了基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法，用于筛选具有不同药物靶点停留时间的化合物。该方法无需使用放射性同位素标记的配体，能够对一系列未知的化合物进行快速、高通量的筛选，具有无污染，操作简单等优点。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：该一种基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法为：(1)收集表达药物靶点的稳转细胞或者组织分离的内源性细胞，等分成两份，分别标记为a组、b组；(2)将a组细胞置于细胞洗脱实验反应缓冲液中，加入过量的待测化合物，在37℃下孵育1小时，使该待测化合物与细胞上表达的药物靶点充分结合；孵育1小时后，将所得细胞混合物转移至离心管中，在4℃下离心3分钟，转速设定为300×g；离心结束后，弃除上清液，以分离未与细胞上药物靶点结合的化合物；分离结束后，加入洗脱实验反应缓冲液，反复吹打分散离心管底部的细胞，充分混匀后在37℃下孵育10分钟，促进待测化合物从药物作用靶点上的解离过程；孵育结束后，将孵育后的细胞混合物再次转移至离心管中，在4℃下离心3分钟，转速设定为300×g，离心结束后弃去上清液，移除经洗脱从药物作用靶点上解离的化合物；重复上述细胞洗脱步骤，包括：吹打分散离心后的细胞、加入细胞洗脱实验反应缓冲液孵育、离心洗脱移除从药物作用靶点上解离的化合物，共计3次；向洗脱后的细胞中，加入细胞功能实验反应缓冲液，在37℃下孵育1小时后，检测细胞功能水平。(3)将b组细胞置于与步骤(2)中相同的细胞功能实验反应缓冲液中，加入与步骤(2)中同等浓度的待测化合物，在37℃下孵育1小时后，检测细胞功能水平。(4)比较上述步骤(2)和步骤(3)中所测细胞功能学水平的差异，具有较短停留时间化合物两组数值差异较大；具有较长停留时间化合物两组数值差异较小。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。图1是一种基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法操作流程图。具体实施方式一种基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法，其方法为：使用高表达人源腺苷A1受体的CHO/ADORA1稳转细胞筛选具有不同停留时间的腺苷A1受体激动剂，具体步骤如下：(1)体外培养并收集CHO/ADORA1细胞，等分成两份，分别标记为a组、b组，每份含4000个细胞；(2)在DMEM/F12培养基中加入0.8U/mL腺苷脱氨酶作为细胞洗脱实验反应缓冲液；将a组细胞置于已配制好的细胞洗脱实验反应缓冲液中；加入过量的待测化合物，在37℃下孵育1小时，使该待测化合物与细胞上表达的腺苷A1受体充分结合；孵育1小时后，将上述细胞混合物转移至离心管中，在4℃下离心3分钟，转速设定为300×g，离心结束后弃除上清液，以分离未与细胞上腺苷A1受体结合的化合物；分离结束后加入细胞洗脱实验反应缓冲液，反复吹打分散离心管底部的细胞，混匀后在37℃下孵育10分钟，促进待测化合物从腺苷A1受体上的解离过程；孵育结束后，将所得细胞混合物再次转移至离心管中，在4℃下离心3分钟，转速设定为300×g，离心结束后弃去上清液，以移除从药物作用靶点上解离的化合物；重复上述细胞洗脱步骤，包括：吹打分散离心后的细胞、加入细胞洗脱实验反应缓冲液孵育、再次离心洗脱移除从药物作用靶点上的解离后化合物，共计3次；在DMEM/F12培养基加入1μM毛喉素、50μM咯利普兰、50μM西洛酰胺以及0.8U/mL腺苷脱氨酶作为细胞功能实验反应缓冲液，在37℃下孵育1小时后，使用环磷酸腺苷测定方法，检测a组细胞中环磷酸腺苷水平；(3)将b组细胞置于与步骤(2)中相同的细胞功能实验反应缓冲液中，加入与步骤(2)中同等浓度的待测化合物，在37℃下孵育1小时后，使用环磷酸腺苷测定方法，检测b组细胞中环磷酸腺苷水平；(4)比较步骤(2)和步骤(3)中所测环磷酸腺苷水平的差异，具有较短停留时间化合物两组数值差异较大，具有较长停留时间化合物两组数值差异较小。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法，其方法步骤特征为：(1)收集表达药物靶点的稳转细胞或者组织分离的内源性细胞，等分成两份，分别标记为a组、b组；(2)将a组细胞置于细胞洗脱实验反应缓冲液中，加入过量的待测化合物，在37℃下孵育1小时，使该待测化合物与细胞上表达的药物靶点充分结合；孵育1小时后，将所得细胞混合物转移至离心管中，在4℃下离心3分钟，转速设定为300×g；离心结束后，弃除上清液，以分离未与细胞上药物靶点结合的化合物；分离结束后，加入洗脱实验反应缓冲液，反复吹打分散离心管底部的细胞，充分混匀后在37℃下孵育10分钟，促进待测化合物从药物作用靶点上的解离过程；孵育结束后，将孵育后的细胞混合物再次转移至离心管中，在4℃下离心3分钟，转速设定为300×g，离心结束后弃去上清液，移除经洗脱从药物作用靶点上解离的化合物；重复上述细胞洗脱步骤，包括：吹打分散离心后的细胞、加入细胞洗脱实验反应缓冲液孵育、离心洗脱移除从药物作用靶点上解离的化合物，共计3次；向洗脱后的细胞中，加入细胞功能实验反应缓冲液，在37℃下孵育1小时后，检测细胞功能水平；(3)将b组细胞置于与步骤(2)中相同的细胞功能实验反应缓冲液中，加入与步骤(2)中同等浓度的待测化合物，在37℃下孵育1小时后，检测细胞功能水平；(4)比较上述步骤(2)和步骤(3)中所测细胞功能学水平的差异，具有较短停留时间化合物两组数值差异较大；具有较长停留时间化合物两组数值差异较小。...

【技术特征摘要】
1.一种基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法，其方法步骤特征为：(1)收集表达药物靶点的稳转细胞或者组织分离的内源性细胞，等分成两份，分别标记为a组、b组；(2)将a组细胞置于细胞洗脱实验反应缓冲液中，加入过量的待测化合物，在37℃下孵育1小时，使该待测化合物与细胞上表达的药物靶点充分结合；孵育1小时后，将所得细胞混合物转移至离心管中，在4℃下离心3分钟，转速设定为300×g；离心结束后，弃除上清液，以分离未与细胞上药物靶点结合的化合物；分离结束后，加入洗脱实验反应缓冲液，反复吹打分散离心管底部的细胞，充分混匀后在37℃下孵育10分钟，促进待测化合物从药物作用靶点上的解离过程；孵育结束后，将孵育后的细胞混合物再次转移至离...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭栋，云意，刘春吉，侯仲志，印晓星，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32