本发明专利技术属于细菌检测领域，具体公开了一种鲟源中间气单胞菌AMth‑1及PCR检测引物及应用，发明专利技术人首次从中华鲟中分离出了一种中间气单胞菌，该细菌为中间气单胞菌（Aeromonas media）AMth‑1，针对该细菌序列设计引物，F1：5'‑GTTGATACCTAATACCTGYCAGC‑3'，R1：5'‑GGACTACCAGGGTATCTAATC‑3'；F2：5'‑CCAGCCCTGCGCCGACAA‑3'，R2：5'‑CACCAGGGTCGCCAGCGCTTCA‑3'，对鲟源中间气单胞菌进行检测，该引物的特异性好，灵敏度高。
Detection primers and application of Aeromonas aeruginosa AMth-1 and PCR in sturgeon source
The invention belongs to the field of bacterial detection, and specifically discloses a sturgeon-derived Aeromonas intermedia AMth_1 and its PCR detection primer and application. For the first time, an Aeromonas intermedia AMth_1 was isolated from Chinese sturgeon. The bacterium is Aeromonas media AMth_1. Primers were designed for the sequence, F1:5'GT. TGAT ACCTAAT ACCTGYCAGC_3', R1:5'GGACTACCAGGTATCTAATC_3', F2:5'CCAGCCCTGCGCCGACAA 3', R2:5'CACCAGGTCGGCCAGGCGGTCA GTCA 3', the primer has good specificity and high sensitivity for the detection of Aeromonas intermedia from sturgeon.
【技术实现步骤摘要】
一种鲟源中间气单胞菌AMth-1及PCR检测引物及应用
本专利技术属于细菌分子检测
，具体涉及一种鲟源中间气单胞菌AMth-1及PCR检测引物及应用。技术背景气单胞菌是一类兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌。早在1986年，Colwell等将气单胞菌属由弧菌科中分出，隶属于新建的气单胞菌科。迄今为止，气单胞菌包括：嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌和中间气单胞菌等14个表型种和16个基因种。气单胞菌在环境中分布广泛，在水生生态系统中以嗜温菌存在。中间气单胞菌(Aeromonasmedia)，是气单胞菌属的一个种，最早于1983年在河水中发现，随后在淤泥、废水、动物体以及人体中都检测到该细菌的存在。中间气单胞菌是一种新发现的条件致病菌，可引起人类和动物的感染，人类的主要症状是腹泻。中间气单胞菌对水生动物致病的报道相对较少，仅王高学等(2007)报道了中间气单胞菌引起刺参腐皮病；黄文明等(2013)报道了中间气单胞菌引起胭脂鱼发病；杨移斌等(2016)通过病原分离纯化鉴定及人工感染等实验,证实中间气单胞菌可引起斑点叉尾鮰出血性死亡。本申请中，申请人首次在人工养殖的中华鲟中发现中间气单胞菌感染，感染症状主要为体表出血和内脏器官的广泛出血。中华鲟和达氏鲟是我国长江流域现存的最为古老的鱼类，属于国家一级重点保护野生动物，中间气单胞菌的发现对这两种鲟鱼的物种保护构成潜在威胁。因此，对鲟源中间气单胞菌进行深入研究具有重要意义。目前对气单胞菌属的研究主要集中在嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)，而对中间气单胞菌的研究甚少。尚未有鲟源中间气单胞菌的公开报道，也更无有效的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了鲟源中间气单胞菌(Aeromonasmedia)AMth-1，所述的中间气单胞菌分离自中华鲟病变组织，该细菌已于2018年4月9日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：中间产气单胞菌(Aeromonasmedia)AMth-1，保藏编号：CCTCCNO:M2018185，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的另一个目的在于提供了鲟源中间气单胞菌AMth-1的特异性序列16SrRNA和cpn60，16SrRNA的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，cpn60的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。本专利技术还有一个目的在于提供了检测鲟源中间气单胞菌AMth-1的引物，所述的引物为F1：5'-GTTGATACCTAATACCTGYCAGC-3'，R1：5'-GGACTACCAGGGTATCTAATC-3'；F2：5'-CCAGCCCTGCGCCGACAA-3'，R2：5'-CACCAGGGTCGCCAGCGCTTCA-3'。本专利技术还有一个目的在于提供了鲟源中间气单胞菌AMth-1的应用，所述的应用包括利用该细菌制备成中间气单胞菌细菌疫苗，或是制备成鲟源中间气单胞菌的实验室对照品，或是用于制备筛选治疗鲟源中间气单胞菌细菌病药物的模型。本专利技术的最后一个目的在于提供一种鲟源中间气单胞菌AMth-1PCR检测引物的应用，包括利用所述的引物制备成鲟源气单胞菌检测试剂盒。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种中间气单胞菌AMth-1，所述的细菌分离自中华鲟病变肝脏组织，该细菌已于2018年4月9日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：中间产气单胞菌(Aeromonasmedia)AMth-1，保藏编号：CCTCCNO:M2018185，地址：中国武汉武汉大学。将中间气单胞菌AMth-1(本专利技术或称为AMth-1)接种到BHI(BD,BectoTMBrainHeartInfusion)固体琼脂培养基上进行扩大培养，28℃培养箱中培养24h后，挑取单菌落在相同条件下在BHI固体琼脂培养基进行二次划线培养，于-80℃甘油保存。中间气单胞菌AMth-1的形态特征：大小为(1～4)μm×(0.1～1)/μm，菌体两端钝圆，单极鞭毛，运动不活泼。无芽胞，有窄的荚膜，属于革兰阴性短杆菌。中间气单胞菌AMth-1的应用，所述的应用包括利用该细菌制备成中间气单胞菌疫苗，或是制备成鲟源中间气单胞菌的实验室对照品，或是用于制备筛选治疗鲟源中间气单胞菌细菌病药物的模型。鲟源中间气单胞菌AMth-1的特异性序列16SrRNA和cpn60，16SrRNA的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，cpn60的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。鲟源中间气单胞菌AMth-1的特异性序列的应用，包括利用16SrRNA和/或cpn60序列用于检测或区分鲟源的中间气单胞菌AMth-1。针对鲟源中间气单胞菌AMth-1的特异性序列16SrRNA和/或cpn60设计的引物也属于本专利技术的保护范围，所述的引物包括但不限于基于该差异序列，利用现有技术设计的诸如荧光定量引物，LAMP引物，数字PCR引物等。一种鲟源中间气单胞菌AMth-1PCR检测引物，包括F1：5'-GTTGATACCTAATACCTGYCAGC-3'，R1：5'-GGACTACCAGGGTATCTAATC-3'；F2：5'-CCAGCCCTGCGCCGACAA-3'，R2：5'-CACCAGGGTCGCCAGCGCTTCA-3'。一种鲟源中间气单胞菌AMth-1PCR检测引物的应用，包括利用针对鲟源中间气单胞菌AMth-1的特异性序列16SrRNA和/或cpn60设计的引物制备成用于检测中间气单胞菌检测试剂盒。优选的，当制备成试剂盒时，该试剂盒的非诊断性检测方法包括：1)提取待测样品的DNA；2)PCR体系采用25μL反应体系：浓度为10μM的两对引物F1、R1或F2、R2分别各取0.5μL加入两只PCR反应管，两个PCR反应管中再分别加入2.5mMdNTPs2μL，25mMMgCl21.5μL，5UTaq聚合酶0.5μL，模板cDNA1μL，10×ThermoPolReactionBuffer2.5μL，用灭菌双蒸水将两管反应体系均补齐至25μL。反应条件，94℃预变性3min；94℃30s、56℃15s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。3)检测结果判定聚合酶链式反应扩增的最终反应产物取4μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。电泳图片显示352bp和385bp特征性条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术首次自中华鲟体内分离出了中间气单胞菌，对于鲟源气单胞菌的研究具备开拓性的意义。1.本专利技术的方法快速简便：本专利技术所建的PCR方法只需数小时，相比较传统细菌分离方法数天时间，极大的提高了检测效率。2.本专利技术的方法特异性强：两对引物对靶序列的特异序列区的识别，保证了PCR方法扩增的高度特异性。附图说明图1为本专利技术提供的两对引物的灵敏度的实验结果示意图；其中，泳道1：原始模板、泳道2：10倍稀释、泳道3：100倍稀释、泳道4：1000倍稀释、泳道5：10000倍稀释、泳道6：100000倍稀释、泳道7：1000000倍稀释。图2为利用本专利技术提供的引物检测感染鲟源中间气单本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离的中间气单胞菌，所述的中间气单胞菌为中间气单胞菌（Aeromonas media）AMth‑1，保藏编号为：CCTCC NO:M2018185。
【技术特征摘要】
1.一种分离的中间气单胞菌，所述的中间气单胞菌为中间气单胞菌（Aeromonasmedia）AMth-1，保藏编号为：CCTCCNO:M2018185。2.SEQIDNO.1所示的序列在检测中间气单胞菌中的应用，所述的中间气单胞菌的保藏编号为：CCTCCNO:M2018185。3.SEQIDNO.2所示的序列在检测中间气单胞菌中的应用，所述的中间气单胞菌的保藏编号为：CCTCCNO:M2018185。4.针对SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示序列设计的引物。5.权利要求4所述的引物在制备检测中间气单胞菌试剂盒中的应用，所述的中间气单胞菌的保藏编号为：CCTCCNO:M2018185。6.权利要求1所述的中间气单胞菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：张书环，邸军，黄君，杜浩，危起伟，周琼，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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