本发明专利技术公开了一株高效降解黄曲霉毒素B1的大肠杆菌（Escherichia coli）CG1061菌株。该菌株已于2018年2月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60324。该菌株分离自鸡盲肠，是一株非致病性大肠杆菌，可高效降解AFB1，可应用于制备黄曲霉毒素B1的脱毒菌剂、脱毒酶制剂等，在食品、饲料加工等领域具有良好的应用前景。
A highly effective strain of Escherichia coli CG1061 for the degradation of aflatoxin B1
The present invention discloses a strain of Escherichia coli CG1061 which can degrade aflatoxin B1 efficiently. The strain was preserved in Guangdong Provincial Microbial Preservation Center on February 1, 2018, and the preservation number was GDMCC NO:60324. Isolated from chicken cecum, this strain is a non-pathogenic E. coli strain, which can degrade AFB1 efficiently. It can be used in the preparation of aflatoxin B1 detoxifying agent, detoxifying enzyme preparation and so on. It has a good application prospect in food and feed processing.
【技术实现步骤摘要】
一株高效降解黄曲霉毒素B1的大肠杆菌CG1061
本专利技术属于霉菌毒素降解
更具体地，涉及一株高效降解黄曲霉毒素B1（AFB1）的大肠杆菌（Escherichiacoli）CG1061菌株。
技术介绍
黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一类由黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，具有致癌、致畸和致细胞突变的作用，其中黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）的毒性最强、危害最大。AFB1对动物的直接毒性表现为肝脏致癌性，间接毒性表现为引起动物的饲料转换率、免疫力、繁殖力等的下降。黄曲霉毒素主要存在于花生、大豆、玉米等粮食作物中，由此加工的食品和饲料流入市场严重威胁人类和畜禽的健康。因此，迫切需要一种高效的脱毒方法去除这类毒素。传统的脱毒方法有物理和化学方法，包括碱法、高温法、射线辐照法、吸附法等。由于这些方法存在特异性不强、营养成分损失大、对环境造成二次污染等缺点，均无法广泛应用。生物脱毒法是利用微生物及其分泌的酶等代谢产物降解黄曲霉毒素的方法，生物脱毒法具有特异性强、效率高以及对食品、饲料和环境没有污染等优点，是黄曲霉毒素脱毒的主要发展方向。目前，已发现多种可以代谢AFB1毒素的微生物，其中真菌主要有糙皮侧耳（Pleurotusostreatus）、假蜜环菌（Armilariellatabescens）、寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）等，还包括一些酵母如酿酒酵母（Saccaromycescerevisiae）等。细菌方面，如诺卡氏菌（Nocardiacorynebacterioides）、结合分支杆菌（Mycobacteriumfluoranthenivorans）、红串红球菌（Rhodococcuserythropolis）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）、假单胞菌（Pseudomonasputida）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）等。目前国内外AFB1降解菌虽有较多报道，但是种类依然受限，且多数降解菌的代谢产物及其毒性不清楚，因此实际应用受到了限制。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有黄曲霉毒素降解技术的缺陷和不足，提供一种能高效降解黄曲霉毒素B1（AFB1）的大肠杆菌，且其代谢产物及产物毒性明确，可应用于饲料和食品原料的脱毒。本专利技术的目的是提供一株高效降解黄曲霉毒素B1的大肠杆菌（Escherichiacoli）CG1061菌株。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术研究发现大肠杆菌对黄曲霉毒素B1具有降解作用，并筛选分离得到了一株高效降解黄曲霉毒素B1的大肠杆菌CG1061菌株，可高效将AFB1降解代谢为无毒产物。因此，所述大肠杆菌CG1061菌株应在本专利技术的保护范围之内，该菌株已于2018年2月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：60324。同时，包含有所述大肠杆菌CG1061菌株的黄曲霉毒素B1脱毒制剂，以及以所述大肠杆菌CG1061菌株为基础构建得到的黄曲霉毒素B1脱毒工程菌，也应在本专利技术的保护范围之内。另外，如下应用也均应在本专利技术的保护范围之内：大肠杆菌CG1061菌株在降解代谢黄曲霉毒素B1方面的应用。所述脱毒制剂或所述工程菌在降解代谢黄曲霉毒素B1方面的应用。优选地，是应用于饲料加工或食品加工领域中黄曲霉毒素B1的脱毒。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术研究发现大肠杆菌对黄曲霉毒素B1具有降解作用，并筛选分离得到了一株高效降解黄曲霉毒素B1的大肠杆菌CG1061菌株，可高效将AFB1降解代谢为无毒产物；且该菌株是一株非致病性大肠杆菌，可应用于制备黄曲霉毒素B1的脱毒菌剂、脱毒酶制剂等，在食品、饲料加工等领域具有良好的应用前景。附图说明图1为鸡肠道微生物菌群对AFB1的降解能力。图2为菌株CG1008对AFB1的降解能力。图3为菌株CG1061的16SrRNA基因系统发育树。图4为大肠杆菌CG1061的致病基因检测结果。图5为大肠杆菌CG1061对AFB1代谢产物毒性。图6为大肠杆菌CG1061对AFB1代谢产物结构分析。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本专利技术所用试剂和材料均为市购。实施例1鸡盲肠微生物AFB1降解活性1、方法（1）从广州五山菜市场随机购买一只活鸡，宰杀后取出鸡盲肠，剪开盲肠取其内容物，加入10mlLB培养基搅拌混匀，静置10min，上清即为盲肠混合微生物。（2）取100μl加入到900μlLB培养基中，添加250µg/mlAFB1母液10μl，使其终浓度为2.5μg/ml。（3）37℃，180r/min，黑暗条件下培养3天。（4）取200μl加入等量的二氯甲烷萃取三次，10000rpm，离心1min，将上清用N2吹干。加入150μL甲醇充分溶解残留物，用0.22μm的尼龙针式滤器过滤至上样瓶。（5）使用高效液相色谱HPLC对AFB1残留量进行检测。（6）AFB1代谢率（%）=(1－AFB1样品峰面积/AFB1对照峰面积)×1002、结果如附图1所示，所分离的鸡肠道微生物菌群对AFB1具有高效的降解能力，降解率为93.9%。实施例2大肠杆菌CG1061的分离鉴定1、平板分离法筛选AFB1降解菌对实施例1所述的鸡肠道微生物菌群进行稀释平板法分离AFB1降解菌。将灭菌的LB固体培养基趁热倒入无菌平板中，凝固后备用。鸡肠道微生物菌群进行梯度稀释，取10-5、10-6两种菌液稀释液中吸取200μL菌悬液放入平板中央位置，每个稀释度做3个重复，用无菌玻璃涂布棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10min。把所有平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24h。根据菌落的形态不同随机挑取50个单菌落，分别接入含150μL液体LB培养基的96孔细胞培养板中，37℃摇床上震荡培养过夜。各取10μL加190μLLB培养液，加入250µg/mlAFB1母液2μl，使其终浓度为2.5μg/ml，以不接菌的LB培养液加AFB1作为空白对照。37℃，180r/min，黑暗条件下培养72h，按照实施例1的方法检测AFB1残留量，筛选出降解活性最高的菌落，并进行单菌落纯化保存，编号CG1061。菌株CG1061的降解活性如附图2所示，代谢率为93.7%。2、高效AFB1降解菌的鉴定形态鉴定的同时，对单菌落CG1061做16SrRNA基因测序，并构建系统发育树（如附图3所示）。综合鉴定结果显示，该菌株属于大肠杆菌（Escherichiacoli），因此，将该菌株命名为大肠杆菌CG1061，已于2018年2月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：60324；保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。实施例3大肠杆菌CG1061致病性检测1、按照DNA提取试剂盒说明书提取大肠杆菌CG1061基因组DNA，按照DiarrhoeagenicE.coliPCRKit(StatensSerumInstitut,Denmark)说明书进行多重PCR，检测目前报道的十本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株高效降解黄曲霉毒素B1的大肠杆菌（Escherichia coli）CG1061菌株，其特征在于，该菌株已于2018年2月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60324。
【技术特征摘要】
1.一株高效降解黄曲霉毒素B1的大肠杆菌（Escherichiacoli）CG1061菌株，其特征在于，该菌株已于2018年2月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：60324。2.一种黄曲霉毒素B1脱毒制剂，其特征在于，包含有权利要求1所述大肠杆菌CG1061...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓诣群，汪玲玲，蒋珺，吴骏，母培强，邓凤如，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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