三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球及制备方法技术

本发明专利技术公开了三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球及制备方法。该方法是将三羟甲基氨基甲烷偶联到经碳二亚胺盐活化的玉米醇溶蛋白上，并以此为载体材料采用反溶剂制备药物输送系统，随后以叶酸、cRGD肽、Her2抗体等功能性分子进行表面修饰，获得出球形度好、载药效率高、粒径分布窄、功能性分子接枝量显著高于未改性玉米醇溶蛋白的功能化载药微球。本发明专利技术所制备的载药微球分散性好，粒径为100～300nm，载药效率为81.48～86.01％，其功能性分子的接枝量平均为未改性玉米醇溶蛋白微球的1.72～1.94倍。本发明专利技术制备的功能性载药微球能够适应不同生理环境，在医药领域具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球及制备方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白，三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白载药微球，及三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白功能性载药微球的制备方法。
技术介绍
制备药物输送系统能够改变药物的药理性质(如溶解度、循环半衰期)、药代动力学及体内生物分布。其中，药物载体材料是决定药物输送载体理化、生化特性的关键因素。玉米醇溶蛋白(全称玉米醇溶贮藏蛋白)作为一种天然疏水性大分子，来源广泛，无毒，非免疫原性，且具有良好的生物相容性及生物可降解性，是少数被FDA允许口服的疏水性生物高分子(PatelA.R.,VelikovK.P.Zeinasasourceoffunctionalcolloidalnano‐andmicrostructures.Curr.Opin.ColloidIn.,2014,19(5):450‐458.)。玉米醇溶蛋白的氨基酸组成非常特别，非极性氨基酸的比例超过50％。在其组成的影响下，玉米醇溶蛋白能够通过二级结构的转换自组装形成稳定的内“疏”外“亲”的密实结构，包埋各种物质，如多糖、DNA、RNA、蛋白质、金属纳米颗粒、量子点、油滴及疏水性药物等。再者，玉米醇溶蛋白上的氨基酸残基带有一定的极性基团(如‐SH、‐COOH、‐NH3以及‐OH)。玉米醇溶蛋白可以这些基团为化学反应位点接枝各种功能性分子，为其适应复杂多变的人体环境提供可能性。因此，无论从来源，成本，安全性，还是从其本身的理化性质、应用拓展性等方面进行考量，玉米醇溶蛋白都是一个优势的药物载体材料。然而，玉米醇溶蛋白的含硫氨基酸比例仅为2.8％，碱性氨基酸比例仅为2.9％，羟基氨基酸的比例总计为13.4％，限制了功能性分子的选择，及以其改性的效果。例如，在均相环境下，玉米醇溶蛋白的儿茶素没食子酸接枝量为2.17％，玉米醇溶蛋白的儿茶素没食子酸接枝量为2.40％，而玉米醇溶蛋白的绿原酸接枝量则为0.69％(LiuF.,MaC.,McClementsD.J.,GaoY..Acomparativestudyofcovalentandnon‐covalentinteractionsbetweenzeinandpolyphenolsinethanol‐watersolution.FoodHydrocolloid.,2017,63:625‐634)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种反应条件温和、设备要求简单的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白及其功能性载药微球及其制备方法，改善玉米醇溶蛋白的理化性质之余，赋予并提高玉米醇溶蛋白的功能特性，制备出适应不同生理环境的功能性载药微球。本专利技术利用玉米醇溶蛋白的酸性氨基酸比例较大，占比27.1％；通过活化玉米醇溶蛋白上的羧基，偶联亲水的、富含羟基的三羟甲基氨基甲烷，改善玉米醇溶蛋白的理化性质，并为玉米醇溶蛋白提供更多的反应位点，提高功能性分子的接枝量。本专利技术目的通过如下技术方案实现：三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，包括如下步骤：1)三羟甲基氨基甲烷与玉米醇溶蛋白的偶联反应：将玉米醇溶蛋白与氨基保护剂二碳酸二叔丁酯按质量比1:1～1.5:1，溶于特定的二甲基亚砜或者乙醇水溶液中，在25～40℃避光反应12～24h，得到玉米醇溶蛋白保护液；在氮气的保护下，分别往玉米醇溶蛋白保护液加入碳二亚胺盐、N‐羟基琥珀酰亚胺及三羟甲基氨基甲烷，在25～40℃避光反应12～24h，得三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白溶液；2)三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白的提取与纯化：在氮气的保护下，往所述的三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白溶液加入浓盐酸，在25～40℃避光反应6～8h；调节pH至5.0～6.0，转移至透析袋中透析，将透析袋中的保留液离心洗涤，冻干，得三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白；3)载药微球的制备：将疏水性药物与冻干的三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白按质量比1:1～1:10，溶于乙醇水溶液；磁力搅拌下，注入pH为2.5～4.5的盐酸水溶液中，稳定后离心去上清，得载药微球；4)载药微球功能化修饰：分别制备溶有不同的功能性分子溶液，将载药微球分散到含功能性分子的溶液，搅拌下反应后，离心去上清，获得功能性载药微球。为进一步实现本专利技术目的，优选地，步骤1)中，所述的碳二亚胺盐与玉米醇溶蛋白摩尔比为1:1～1.5:1；所述的N‐羟基琥珀酰亚胺与玉米醇溶蛋白摩尔比为1.2:1～1.75:1；所述的三羟甲基氨基甲烷与玉米醇溶蛋白质量比为1:10～10:1。优选地，步骤1)中，所述的碳二亚胺盐为二环己基碳二亚胺(二甲基亚砜)或1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐；所述的玉米醇溶蛋白的蛋白纯度≥97％；所述的乙醇水溶液体积分数为50～95％。优选地，步骤2)中，所述的浓盐酸的质量浓度为36.0～38.0％；所述浓盐酸的用量是三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白溶液体积的1/4～1/2；所述透析的时间为1～2天；所述离心洗涤的次数为3次以上。优选地，步骤2)，步骤3)调pH值，采用浓度为0.1mol/L的HCl溶液或浓度为0.1mol/L的NaOH溶液。优选地，步骤3)中，所述疏水性药物为苏尼替尼、吉非替尼、羟基喜树碱或白藜芦醇；所述乙醇水溶液的体积分数为70～80％；所述盐酸水溶液的用量为5～20倍，稳定时间为1～2h。优选地，所述的功能性分子为能够靶向癌细胞的cRGD肽、叶酸、Her2抗体、壳聚糖或具有抗氧化活性的儿茶素没食子酸；cRGD肽、叶酸、Her2抗体和儿茶素没食子酸预先使用1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐与N‐羟基琥珀酰亚胺活化；壳聚糖预先在0.4mol/L的NaOH溶液下偶联一氯醋酸的壳聚糖。优选地，活化的cRGD肽、叶酸、Her2抗体以及儿茶素没食子酸溶于pH值为8～10的碱性溶液，避光反应24～72h；一氯醋酸‐壳聚糖溶于90℃的水溶液，避光反应1h。优选地，碱性溶液为PBS、Tris‐HCl、HEPES及硼酸缓冲溶液的一种。一种三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球，由上述制备方法制得，粒径为100～300nm，载药效率为81.48～86.01％，其功能性分子的接枝量平均为未改性玉米醇溶蛋白微球1.72～1.94倍。优选的，所述的溶液皆用去离子水配置。相对于现有技术，本专利技术具有如下优点：1)本专利技术在反应过程中避免了玉米醇溶蛋白在活化阶段的自聚，避免了玉米醇溶蛋白上极性基团的消耗。2)本专利技术成功将三羟甲基氨基甲烷偶联到玉米醇溶蛋白上，显著改善了玉米醇溶蛋白的理化性质，如提高了改性玉米醇溶蛋白在原蛋白等电点下的溶解度等。3)本专利技术制备的微球，球形度好，粒径分布均一，粒径分布在100～300nm左右，载药效率在81.48～86.01％，适用于体内输送。4)本专利技术的三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白基载药微球的功能性分子接枝量平均为未改性玉米醇溶蛋白微球1.72～1.94倍，使微球的功能特性更加显著。另外，通过调节三羟甲基氨基甲烷用量可调控玉米醇溶蛋白的可改性基团的数量，从而调控载药微球的控缓释特性。因此，本专利技术拓展了玉米醇溶蛋白在药物输送系统上的应用。附图说明图1为实施例1的三羟甲基氨基甲烷‐玉米本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)三羟甲基氨基甲烷与玉米醇溶蛋白的偶联反应：将玉米醇溶蛋白与氨基保护剂二碳酸二叔丁酯按质量比1:1～1.5:1，溶于特定的二甲基亚砜或者乙醇水溶液中，在25～40℃避光反应12～24h，得到玉米醇溶蛋白保护液；在氮气的保护下，分别往玉米醇溶蛋白保护液加入碳二亚胺盐、N‐羟基琥珀酰亚胺及三羟甲基氨基甲烷，在25～40℃避光反应12～24h，得三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白溶液；2)三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白的提取与纯化：在氮气的保护下，往所述的三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白溶液加入浓盐酸，在25～40℃避光反应6～8h；调节pH至5.0～6.0，转移至透析袋中透析，将透析袋中的保留液离心洗涤，冻干，得三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白；3)载药微球的制备：将疏水性药物与冻干的三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白按质量比1:1～1:10，溶于乙醇水溶液；磁力搅拌下，注入pH为2.5～4.5的盐酸水溶液中，稳定后离心去上清，得载药微球；4)载药微球功能化修饰：分别制备溶有不同的功能性分子溶液，将载药微球分散到含功能性分子的溶液，搅拌下反应后，离心去上清，获得功能性载药微球。...

【技术特征摘要】
1.三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)三羟甲基氨基甲烷与玉米醇溶蛋白的偶联反应：将玉米醇溶蛋白与氨基保护剂二碳酸二叔丁酯按质量比1:1～1.5:1，溶于特定的二甲基亚砜或者乙醇水溶液中，在25～40℃避光反应12～24h，得到玉米醇溶蛋白保护液；在氮气的保护下，分别往玉米醇溶蛋白保护液加入碳二亚胺盐、N‐羟基琥珀酰亚胺及三羟甲基氨基甲烷，在25～40℃避光反应12～24h，得三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白溶液；2)三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白的提取与纯化：在氮气的保护下，往所述的三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白溶液加入浓盐酸，在25～40℃避光反应6～8h；调节pH至5.0～6.0，转移至透析袋中透析，将透析袋中的保留液离心洗涤，冻干，得三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白；3)载药微球的制备：将疏水性药物与冻干的三羟甲基氨基甲烷‐玉米醇溶蛋白按质量比1:1～1:10，溶于乙醇水溶液；磁力搅拌下，注入pH为2.5～4.5的盐酸水溶液中，稳定后离心去上清，得载药微球；4)载药微球功能化修饰：分别制备溶有不同的功能性分子溶液，将载药微球分散到含功能性分子的溶液，搅拌下反应后，离心去上清，获得功能性载药微球。2.根据权利要求1所述的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述的碳二亚胺盐与玉米醇溶蛋白摩尔比为1:1～1.5:1；所述的N‐羟基琥珀酰亚胺与玉米醇溶蛋白摩尔比为1.2:1～1.75:1；所述的三羟甲基氨基甲烷与玉米醇溶蛋白质量比为1:10～10:1。3.根据权利要求1所述的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述的碳二亚胺盐为二环己基碳二亚胺或1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐；所述的玉米醇溶蛋白的蛋白纯度≥97％；所述的乙醇水溶液体积分数为50～95％。4.根据权利要求1所述的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：江燕斌，庞嘉凤，卢珊，李致贤，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44