保护性HPV卵黄抗体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种HPV L1重组微环DNA的卵黄抗体及其在预防/治疗HPV感染中的应用。其中HPV L1重组微环DNA包含HPV16的L1基因片段以及信号肽序列，将其作为核酸抗原直接免疫产蛋鸡获得本发明专利技术的卵黄抗体。DNA核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡所获得的卵黄抗体(IgY)的生物活性远超一般技术(皮下注射蛋白抗原)制备的卵黄抗体，抗体效价更高，特异性更强。本发明专利技术的卵黄抗体可用于制备预防/治疗HPV感染的药物，阴道用药对HPV阳性患者输入高活性抗HPV抗体，结合纳米脂质体的方法，抗体跨膜进入细胞，直接中和细胞内的HPV病毒。本发明专利技术的卵黄抗体对于预防宫颈癌有重要意义。

Protective HPV yolk antibody and its application

The invention belongs to the field of biomedicine, in particular to an egg yolk antibody of HPV L1 recombinant microcyclic DNA and its application in the prevention/treatment of HPV infection. The HPV L1 recombinant microcyclic DNA contains the L1 gene fragment of HPV 16 and the signal peptide sequence, which is used as the nucleic acid antigen to immunize laying hens directly to obtain the yolk antibody of the present invention. The biological activity of egg yolk antibody (IgY) obtained by intramuscular immunization of laying hens with DNA nucleic acid antigen is much higher than that of egg yolk antibody prepared by general technology (subcutaneous injection of protein antigen), and the antibody has higher titer and specificity. The yolk antibody of the invention can be used for preparing medicines for preventing/treating HPV infection. Vaginal medicines inject highly active anti-HPV antibodies into HPV-positive patients, and combine the method of nano-liposome, the antibodies enter the cell through the membrane, and directly neutralize the HPV virus in the cell. The egg yolk antibody of the invention has important significance for preventing cervical cancer.

【技术实现步骤摘要】
保护性HPV卵黄抗体及其应用
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种HPVL1重组微环DNA的卵黄抗体及其在预防/治疗HPV感染的应用。
技术介绍
宫颈癌占女性妇科恶性肿瘤的第二位，现已成为威胁女性健康的重要疾患，中国每年死于宫颈癌的人数将近5万，宫颈癌的病因研究一直为国内外学者所重视，研究发现引起宫颈癌的关键是HPV的感染。HPV属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属，是球形、双链环状DNA病毒。HPV主要通过直接或间接接触污染物品或通过性传播感染人类。HPV的感染有宿主特异性和组织特异性，只能感染人类的皮肤和粘膜受损的基底细胞。HPV经损伤的宫颈粘膜首先感染基底细胞层，病毒以少量游离DNA状态潜伏在基底细胞内，以实现免疫逃逸。当基底细胞不断分化、成熟、向粘膜表层迁移，HPV病毒就大量增殖。随着粘膜表层上皮细胞的凋亡，病毒颗粒大量释放到上皮表面，作为新的感染源可进一步加重感染。长期HPV持续感染导致宿主细胞相关基因表达发生变化，可逐渐发展为宫颈癌。HPV至今已鉴定明确的大约有200多个亚型，根据其致病和预后不同又可分为高危型HPV(HR-HPV)和低危型HPV(LR-HPV)，其中HR-HPV15种，包括HR-HPV16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、53、58型等，感染后可引起癌前病变和宫颈癌。其中HPV16和HPV18是最主要的流行株。HPVL1衣壳蛋白是人乳头瘤病毒的主要结构蛋白,是病毒感染细胞和细胞免疫反应攻击病毒的主要靶位，且该蛋白较为保守。因此可以针对L1蛋白开发预防/治疗HPV感染的药物。卵黄抗体(Immunoglobulinofyolk,IgY)为通过免疫注射产蛋鸡，由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗。DNA核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡所获得的卵黄抗体(IgY)的生物活性远超一般技术(皮下注射蛋白抗原)制备的卵黄抗体，抗体效价更高，特异性更强。而目前尚无核酸抗原免疫获得的HPVL1卵黄抗体用于预防宫颈癌的先例。目前临床上对宫颈粘膜细胞内HPV病毒无有效治疗方法。若能够在病人HPV阳性时使其快速转阴，无疑将在很大程度上降低病人由HPV阳性转为宫颈癌的风险。因此开发一种核酸抗原免疫获得的HPVL1卵黄抗体以及其在预防/治疗HPV感染中的应用，对于宫颈癌易感者的预防以及HPV阳性患者快速转阴具有重大意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种重组HPVL1片段，其选择的HPVL1保守性强。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：重组HPV16L1片段，其由以下部分依次连接组成：信号肽序列区、HPV16亚型的L1基因、标签区；所述HPV16亚型的L1基因序列为SEQIDNO:1所示。HPVL1衣壳蛋白是人乳头瘤病毒的主要结构蛋白,是病毒感染细胞和细胞免疫反应攻击病毒的主要靶位。HPV-16和18菌株的L1蛋白较保守，具有较多相同的抗原表位，并有文献报道免疫HPV-16L1VLP也能交叉保护HPV-18，且L1蛋白比较大。基于以上考虑，本专利技术的重组HPVL1片段含全长的HPV16L1蛋白基因。由信号肽序列表达的信号肽诱导L1蛋白分泌至细胞外，从而增强抗原特异性体液免疫应答及细胞免疫应答。作为优选的方案，上述信号肽序列区为选自组织型纤溶酶原激活物tPa、HSVgDs及生长激素的分泌信号肽对应的核苷酸序列中的一种或多种。进一步优选的，上述信号肽序列区为组织型纤溶酶原激活物tPa。进一步，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。作为优选的方案，上述标签区为HIS标签，标签区的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。作为优选的方案，上述HPV-L1重组片段末端为终止密码子。综上，作为最优选，本专利技术的HPV-L1重组微环DNA的HPV-L1重组片段的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。本专利技术的目的之二在于提供一种核酸抗原，其为包含HPV-L1的重组微环DNA，微环DNA作为HPV-L1重组片段的载体具有稳定、安全的优点。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种HPV-L1重组微环DNA，其连接有目的一的HPV-L1重组片段。微环DNA是亲本质粒(parentalplasmid，PP)体内位点特异性重组的产物。在携带真核表达框的亲本质粒两侧插入重组酶识别位点，诱导体内相关重组酶表达，该重组酶将识别位点中间的DNA序列切断，亲本质粒被分成2个超螺旋分子，即具有复制功能的小质粒(miniplasmid，MP)和携带真核表达框的微环(minicircle，MC)DNA。微环DNA是传统质粒在大肠杆菌中通过位点特异性重组得到的一种新颖的小环超螺旋表达框，其缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列，增强了在临床应用上的安全性，可在体内长期表达高水平的转基因产物。MC在结构、转基因表达的持久性、细胞内的稳定性上，与共价键密闭环状DNA(cccDNA)相同，使MC成为安全、高效的理想载体。与传统质粒和病毒载体比较，微环DNA在动物细胞内表达外源基因具有一系列独特的优势：1)不整合入宿主细胞基因组，不会诱发新的突变，较病毒载体更为安全；2)可在工程细菌内大量扩增，制备工艺简单，产业化生产成本低；3)去除了传统质粒中的抑制信号，表达外源基因较传统质粒稳定，高效。因此本专利技术的重组微环DNA具有安全、稳定、高效、产业化生产成本低的优点。本专利技术的重组微环DNA的制备方法,包括以下步骤：1)设计两端加BglII和SalI酶切位点的HPV-L1重组片段，并合成，得目的基因；2)将上述目的基因片段和ZY781载体用BglII和SalI同时双酶切，胶回收后按常规方法将目的片段克隆至载体ZY781的多克隆位点上，得重组质粒，即为亲本质粒(PP)；3)用上述亲本质粒转化大肠杆菌ZYCY10P3S2T，过夜培养，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段；4)将上述测序正确的大肠杆菌接入含50μg/mlkana的TB培养液中，37℃，250rpm过夜培养；5)取过夜培养的菌液与MinicleInductionMix按等体积混合，于32℃，250rpm反应5h-8h。反应完结束后，离心，提取质粒，即为重组微环DNA质粒。其结构见附图1。本专利技术的目的之三在于提供一种重组微环DNA作为核酸抗原制备的卵黄抗体，其抗体效价高，特异性强。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：本专利技术的目的二的重组微环DNA作为核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡，获得卵黄抗体(IgY)。DNA核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡所获得的卵黄抗体(IgY)的生物活性远超一般技术(皮下注射蛋白抗原)制备的卵黄抗体，抗体效价更高，特异性更强。因此本专利技术的HPVL1的卵黄抗体采用重组微环DNA作为核酸抗原免疫获得，具有抗体效价高，特异性强的优点。本专利技术的目的之四在于提供一种上述HPVL1的卵黄抗体的制备方法，其制备较为简单，且成本较低。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：本专利技术的HPVL1的卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：1)目的二的重组微环DNA作为抗原，免疫产蛋鸡；2)取免疫后的产蛋鸡的鸡蛋，获得蛋黄；3)纯化蛋黄中的所述重组微环DNA的卵黄抗体。卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组HPV16L1片段，其特征在于，由以下部分依次连接组成：信号肽序列区、HPV16亚型的L1基因、标签区；所述HPV16亚型的L1基因序列为SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.重组HPV16L1片段，其特征在于，由以下部分依次连接组成：信号肽序列区、HPV16亚型的L1基因、标签区；所述HPV16亚型的L1基因序列为SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的重组片段，其特征在于，所述信号肽序列区为选自组织型纤溶酶原激活物tPa、HSVgDs及生长激素的分泌信号肽对应的核苷酸序列中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的重组片段，其特征在于，所述信号肽序列区的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。4.根据权利要求1所述的重组片段，其特征在于，所述标签区的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。5.根据权利要求1所述的重组片段，其特征在于，所述核苷酸片段的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。6.重组微环DNA，其特征在于，所述重组微环DNA包含权利要求1所述的重组HPV16L1片段。7.权利要求6所述的重组微环DNA作为核酸抗原制备的卵黄抗体。8.权利要求7所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)权利要求1所述的重组微环DNA作为抗原，免疫产蛋鸡；2)取免疫后的产蛋鸡的鸡蛋，获得蛋黄；3)纯化蛋黄中的所述重组微环DNA的...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞以芹，谢亦武，吴必杰，魏勇，
申请(专利权)人：江苏润洁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32