上转换发光近红外和彩色成像多功能宽场正置显微系统技术方案

本发明专利技术公开了一种上转换发光近红外和彩色成像多功能宽场正置显微系统，该显微系统在正置荧光显微镜镜体内由下至上依次集成设置有近红外通透物镜、激发滤光片转盘、二向色镜、发射滤光片转盘、第二可调式反射镜和高灵敏度检测器，在正置荧光显微镜镜体内位于第二可调式反射镜的侧面设置有彩色相机，在正置荧光显微镜镜体的外部位于安装二向色镜位置的侧面依次安装有第一可调试反射镜、准直扩束镜和激光器，白光光源设置于第一可调式反射镜的侧端。本系统通过近红外光激发，采用高灵敏度探测器检测探针的可见光或近红外光发射，同时可以通过切换实现样本的彩色成像，最终实现探针的材料、细胞或者生物组织的实时、非侵入式的高灵敏度成像。

Upconversion luminescence near infrared and color imaging multi-function wide field positive microscope system

The present invention discloses a upconversion luminescence near infrared (NIR) and color imaging multi-functional wide-field forward microscopy system, which integrates a NIR permeable objective lens, an excitation filter rotating disk, a dichroic mirror, an emission filter rotating disk, a second adjustable mirror and a high level in the forward fluorescence microscope from bottom to top. A sensitivity detector is provided with a color camera on the side of the second adjustable mirror in the forward fluorescence microscope body, a first adjustable mirror, a collimating beam expander and a laser on the side of the forward fluorescence microscope body at the position of the dichroic mirror, and a white light source on the first adjustable mirror. The side of the adjustable reflector. The system uses a high sensitive detector to detect the visible light or near infrared light emission of the probe by near infrared light excitation. At the same time, the color imaging of the sample can be realized by switching. Finally, the real-time and non-invasive high sensitive imaging of the probe materials, cells or biological tissues can be realized.

【技术实现步骤摘要】
上转换发光近红外和彩色成像多功能宽场正置显微系统
本专利技术属于荧光成像
，具体的说是涉及一种上转换发光近红外和彩色成像多功能宽场正置显微系统。
技术介绍
光学显微镜是一种利用光学透镜产生影像放大效应的显微镜，正置显微镜是光学显微镜的一种，在透射光观察下，光源由机身下面经过聚光镜到达样品，再穿过位于样品上方的物镜，然后借由反射镜和透镜到达观察者的眼睛或其他成像仪器，正置显微镜的优点是结构简单，易于改造。荧光显微成像技术是指使用荧光来产生一个图像的技术。样品被照射特定波长或波段的光，其被荧光团吸收，导致它们发出更长波长的光，例如和被吸收的光不同的颜色。通过使用光谱发射滤片，该照明光被从弱得多的发射荧光中分离出来。近年来，在生物学研究中，荧光标签被广泛地使用来标定生物分子，使荧光显微镜变得更加重要，荧光显微镜是以水银灯或氙气灯为光源，搭配具激发滤片、发散滤片组的光学仪器。荧光显微成像系统被广泛用于细胞生物学的研究中，是细胞水平研究必备的工具之一。近红外荧光成像属于光学成像的一种，近红外光源的波长范围是700～900nm，为人们最早发现的非可见光区域，在可见光区400～700nm的成像存在着许多问题，比如会受到生物组织中内源性物质，如有氧、无氧血红蛋白、黑色素、水和胆红素等的吸收、散射等对光学成像的影响。然后在近红外区域，组织的吸收、散射和自发荧光背景都很低，近红外光源能在生物组织内达到最大穿透深度，并能进行深层组织成像，因而称此波段范围为“近红外组织透明窗口”。上转换荧光成像基于上转换荧光探针，有别于其他的荧光探针，在长波长的外界光源激发下可以发射短波长的荧光，这种独特的发光性质使得上转换荧光探针在进行荧光成像时，可以大大避免生物组织的自发荧光干扰，而且上转换荧光探针的光稳定性也很高，不容易发生荧光淬灭等问题，适用于生物体的长期荧光成像观测。荧光显微系统其造价相对低廉、成像速度快、灵敏度高，近红外光和上转换发光均具有成像深度好、噪音低的优点，基于上述优点，发展能够实现近红外光和上转换发光的显微成像显微系统十分必要，同时由于与HE染色等病理检测共定位的需要，简单切换即实现原位的彩色成像、近红外发光和上转换发光成像对细胞水平的研究具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术存在的不足，提供一种上转换发光近红外和彩色成像多功能宽场正置显微系统。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种上转换发光近红外和彩色成像多功能宽场正置显微系统，该多功能宽场正置显微系统主要由正置荧光显微镜镜体、激光器、准直扩束镜、白光光源、第一可调式反射镜、二向色镜、激发滤光片转盘、近红外通透物镜、发射滤光片转盘、第二可调式反射镜、高灵敏度检测器和彩色相机组成；在正置荧光显微镜镜体内由下至上依次集成设置有近红外通透物镜、激发滤光片转盘、二向色镜、发射滤光片转盘、第二可调式反射镜和高灵敏度检测器，在正置荧光显微镜镜体内位于第二可调式反射镜的侧面设置有彩色相机，在正置荧光显微镜镜体的外部位于安装二向色镜位置的侧面依次安装有第一可调试反射镜、准直扩束镜和激光器，白光光源设置于第一可调式反射镜的上方。激发滤光片转盘含有激发滤光片，发射滤光片转盘含有发射光滤光片，激发滤光片和发射光滤光片采用短通滤光片、带通滤光片或长通滤光片。激光器采用中心波长为980nm、808nm或730nm的激光器。白光光源采用汞灯或LED灯。高灵敏度检测器采用sCMOS检测器或制冷性EMCCD检测器。本专利技术正置显微系统中各部件的功能为：1、正置荧光显微镜镜体作为各部件连接和物理固定。2、激光器作为近红外发光成像和上转换发光成像的激发光源。3、准直扩束镜用于激光器的准直和扩束。4、白光光源作为激发光的发射光源。5、第一可调式反射镜可以对光源进行切换，切换激光光源和白光光源。6、二向色镜可以反射激发光到样品对其进行激发，同时可以透过发射光，使发射光可以被检测器接收。7、激发滤光片转盘含有激发滤光片，激发滤光片能够选择性的透过激光器、汞灯、LED光源发射光作为激发光。8、近红外通透物镜专用于红外光的透镜组。9、发射滤光片转盘含有发射光滤光片，发射光滤光片能够选择性的透过目标发射光。10、第二可调式反射镜可以用于实现高灵敏度检测器和彩色相机之间的自由切换。11、高灵敏度检测器用于收集样本激发后发射的荧光。12、彩色相机用于可见光波段的彩色成像。正置荧光显微镜：NikonNi-U是一款扩展性极强的科研级正置显微镜，采用无限远光学系统，可方便地搭载其他附件。在此系统中搭载了双层荧光转盘，每层荧光转盘具备六个滤光块空位，系统还配备了双相机端口及双光源接口，以同时满足生物荧光材料及上转换发光材料的应用。在主要光学部件上，如物镜选择近红外透过率较高例如大于70％的平场荧光物镜。另外在确保不影响成像的前提下，移除光路中对红外光有阻挡作用的光学部件，从而最大限度地提高整个光学系统在近红外光的通过率。激光器采用高功率大芯径多模光纤，以达到更强的激发光强度。光纤采用多模光纤，芯径200um，外加准直扩束镜进而实现均匀的视场照明。相机除了精准的滤光片组合及高透过率的物镜外，为了得到高信噪比的荧光图像，系统还需配备高灵敏度的探测器，如EMCCD或sCMOS。二向色镜与普通荧光用的二向色镜不同，本专利技术中采用的为短通型滤光片，即短于分光波长的光透过，而长于分光波长的光被反射。被反射的近红外光照射到样品后，样品激发出的荧光通过第一阻挡滤光片，让400nm～850nm的光透过，其余波长的光被过滤掉，避免对背景信号造成干扰。要求二向色镜及第一阻拦滤光片的OD值至少大于6，以增加信噪比。本专利技术中的正置显微系统采用的是美国Chroma公司的ZT1064rdc-sp二向色镜及ET850SP-2P，光谱图如图2所示，其中ZT1064rdc-sp为灰色平滑状线，ET850SP-2P为黑色锯齿状线。激发和发射滤光片：为了进一步区分出不同波长的发射光，系统中增加了第二阻挡滤光片，波长分别为ET550/50M、ET630/75M及ET811/80M，光谱图如图3、图4及图5，其中黑色线为第一阻挡滤光片。此外，由于常规的荧光显微镜光源采用的是汞灯，热量比较高，所以光路通常会有隔热片。而隔热片会将近红外及红外光阻挡，所以本系统对显微镜荧光光路中的相关光学部件也进行了移除。激发滤光片转盘和发射滤光片转盘可以任意更换滤光片，在成像过程中也可实现滤光片的自由切换。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种上转换发光近红外成像和彩色显微成像系统，该系统能够利用近红外光、上转换发光信噪比高、噪音低的特点，通过近红外光激发，采用高灵敏度探测器检测探针的可见光或近红外光发射，同时可以通过切换实现样本的彩色成像，最终实现探针的材料、细胞或者生物组织的实时、非侵入式的高灵敏度成像。本专利技术中的显微系统能够发射激发光，通过对标记有正常荧光探针、近红外荧光探针、上转换发光探针的材料、细胞、组织和活体动物进行实时的高信噪比的荧光显微成像，同时可以在不移动样本和移动镜头的情况下，使用彩色相机进行共定位彩色成像。本专利技术通过合理搭配滤光片光谱范围，选择高透过率的显微镜物镜及高OD值滤光片，同时配备高灵敏度的探测器，在宽场照明下同样可以达到高信噪比的上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种上转换发光近红外和彩色成像多功能宽场正置显微系统，其特征在于：所述多功能宽场正置显微系统主要由正置荧光显微镜镜体、激光器、准直扩束镜、白光光源、第一可调式反射镜、二向色镜、激发滤光片转盘、近红外通透物镜、发射滤光片转盘、第二可调式反射镜、高灵敏度检测器和彩色相机组成；在所述正置荧光显微镜镜体内由下至上依次集成设置有所述近红外通透物镜、激发滤光片转盘、二向色镜、发射滤光片转盘、第二可调式反射镜和高灵敏度检测器，在所述正置荧光显微镜镜体内位于所述第二可调式反射镜的侧面设置有所述彩色相机，在所述正置荧光显微镜镜体的外部位于安装所述二向色镜位置的侧面依次安装有所述第一可调试反射镜、准直扩束镜和激光器，所述白光光源设置于所述第一可调式反射镜的上方。

【技术特征摘要】
1.一种上转换发光近红外和彩色成像多功能宽场正置显微系统，其特征在于：所述多功能宽场正置显微系统主要由正置荧光显微镜镜体、激光器、准直扩束镜、白光光源、第一可调式反射镜、二向色镜、激发滤光片转盘、近红外通透物镜、发射滤光片转盘、第二可调式反射镜、高灵敏度检测器和彩色相机组成；在所述正置荧光显微镜镜体内由下至上依次集成设置有所述近红外通透物镜、激发滤光片转盘、二向色镜、发射滤光片转盘、第二可调式反射镜和高灵敏度检测器，在所述正置荧光显微镜镜体内位于所述第二可调式反射镜的侧面设置有所述彩色相机，在所述正置荧光显微镜镜体的外部位于安装所述二向色镜位置的侧面依次安装有所述第一可调试反射镜、准直扩束镜和激光器，所述白光光源设置于所述第一可调式反射镜的上方。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：孙筠，陆嘉德，孔琳，李钰晧，程竞仪，陈文，秦晓嘉，刘杰，
申请(专利权)人：上海市质子重离子临床技术研发中心，
类型：发明
国别省市：上海,31