含酪丝缬肽并基于D构型短肽自组装的抗癌超分子水凝胶的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种含酪丝缬肽的抗癌超分子水凝胶的制备方法与应用。以D构型的五肽NapGDFDFDY作为自组装成胶因子，将抗癌短肽YSV共价修饰到凝胶五肽的C末端，通过多肽固相合成得到目的产物NapGDFDFDYGYSV，经加热‑冷却后形成宏观可见的水凝胶，用于提高YSV的抗癌活性。本发明专利技术的抗癌超分子水凝胶微观形貌由纳米纤维构成，在体内外对包括肝癌在内的多种肿瘤表现出较好的抑制作用。其制备简单，产率高，成本低，在体内具有良好的生物相容性和降解性，容易向临床方向转化。与单独抗癌短肽YSV相比，本发明专利技术得到的纳米材料在内外能够显著提高其抗蛋白酶降解的能力和抑制肿瘤生长的效果，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
含酪丝缬肽并基于D构型短肽自组装的抗癌超分子水凝胶的制备方法与应用
本专利技术属于纳米生物医药材料领域，涉及一种含酪丝缬肽(YSV)并基于D构型短肽自组装的新型抗癌超分子水凝胶的制备方法及其在增强抗癌活性中的应用。
技术介绍
癌症是导致世界范围内死亡的主要疾病，如何战胜癌症是现代科学技术面临的巨大挑战。在针对癌症治疗的多种方式中，化疗由于具有高效性成为大多数癌症治疗不可缺少的选择。近来，多肽类抗癌药物作为一种新的化疗药物受到了越来越多研究者的关注。相比于传统化疗药物，多肽类抗癌药具有溶解性好、免疫原性低及生物相容性好等优点。但同时也面临着细胞摄取低、组织渗透差、生物利用度低、从血液或肾脏快速清除以及容易被蛋白酶降解稳定性差等缺陷。因此，如何对多肽类抗癌药物进行合理有效的结构修饰以解决这些缺陷并提高其抗癌活性是推进其临床应用面临的主要挑战之一。为了解决传统化疗局限，科研人员发展了多种纳米载体包括聚合物水凝胶、脂质体、囊泡、聚合物纳米粒子以及无机材料等来做为药物载体。在这些纳米载体的辅助下，药物能够通过物理包裹或化学交联被递送到体内病灶位点实现选择性和响应性释放，从而相比于游离药物表现出更好的治疗效果和更少的副作用。其中，基于多肽自组装形成的超分子水凝胶由于具备容易设计和合成、成本低以及生物相容性好等优点，在药物递送中表现出了较大的应用潜能。多肽水凝胶是小分子多肽在水中通过非共价键相互作用形成三维网状纳米纤维后将水分子包裹于其中而形成的一类宏观可见的凝胶。其中，作为网状堆积结构单元的多肽一般由天然存在的L构型氨基酸组成，容易被体内存在的蛋白酶催化降解导致多肽纳米纤维在体内稳定性较差。为了解决这一问题，研究人员用蛋白酶不易降解的D构型氨基酸取代L构型氨基酸，制备了多种基于D构型多肽自组装的水凝胶或纳米纤维。通过非共价的方式，疏水性化疗药物包括紫杉醇、喜树碱、阿霉素等均可被包裹在水凝胶中，从而增加这些药物分子的溶解性达到更好的治疗效果。但是，这种非共价物理包裹的方式存在药物负载率低、药物分子与载体易分离、可重复性差等问题。如何解决这些问题对进一步推进疏水性抗癌药物在临床治疗中的应用具有重要意义。酪丝缬肽(YSV)是我国自主研发的小肽类抗癌药物，来源于猪脾脏组织经高通量筛选获得，具有分子量小、毒性低等优势。经前期实验证明，酪丝缬肽能够通过干扰细胞复制周期和抑制组蛋白去乙酰化酶活性发挥抗肿瘤作用，对非小细胞肺癌、肝癌等多种肿瘤均有一定的抗癌活性，目前已经被批准进入临床前期研究。然而，前期实验结果均表明酪丝缬肽只有在较高浓度下才能发挥疗效，并且在体内被蛋白酶快速降解具有极短的半衰期，从而导致临床推广及应用受到极大的限制。因此，寻找合适有效的方法对酪丝缬肽进行结构修饰和改造以提高其抗蛋白酶降解的稳定性和抗癌活性是迫切需要解决的问题，对于将其真正应用于临床癌症治疗从而造福患者和社会具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决L构型氨基酸及L构型活性肽抗蛋白酶降解能力差的问题，提供一种含酪丝缬肽并基于D构型短肽自组装的新型抗癌超分子水凝胶及其制备方法与应用。并对本专利技术用于增强酪丝缬肽稳定性和抗癌活性的能力进行评估。本专利技术技术方案：一种含酪丝缬肽(YSV)并基于D构型短肽自组装的新型抗癌超分子水凝胶，它是利用多肽Fmoc固相合成法，将抗癌短肽YSV共价修饰到成胶短肽NapGDFDFDY的C末端(羧基端)，合成目的多肽NapGDFDFDYGYSV，再经过反相高效液相色谱分离纯化得到纯度大于95％的目的产物NapGDFDFDYGYSV纯品，该产物能够以大于1mg/mL的浓度在PBS中经加热-冷却形成肉眼可见的水凝胶。该抗癌超分子水凝胶具有良好的生物相容性，并且能够克服酪丝缬肽自身容易被蛋白酶降解的缺点，提高其稳定性和生物利用度，并提高酪丝缬肽细胞摄取量，增强其在体外和体内对多种癌细胞的抗癌活性。同时，具有制备简单、生产成本低且产率高的优势，使得这种抗癌超分子水凝胶易于进行临床转化应用。本专利技术进一步公开了含酪丝缬肽(YSV)并基于D构型短肽自组装的新型抗癌超分子水凝胶的制备方法，其步骤如下：1)将固相合成得到的NapGDFDFDYGYSV粗品溶于DMSO，溶解后过0.25μm有机滤膜，过滤后的样品使用反相高效液相色谱进行分离纯化，收集目的产物峰，将收集得到的产物溶液进行真空减压旋转浓缩，除去甲醇后加入适量超纯水于-80℃冰箱冷冻，经冷冻干燥后得到白色粉末状多肽纯品；2)将多肽纯品溶于PBS中，并用碳酸钠调节pH至7.0～7.4，配置成终浓度大于1mg/mL的溶液；使用移液枪吸取100～500μL样品溶液于玻璃小瓶中，在酒精灯上加热至样品完全溶解后，静置于桌面上冷却，5～10分钟内即可形成宏观可见的水凝胶。其中NapGDFDFDYGYSV粗品的固相合成制备步骤如下：1)称取0.5～1g三苯基甲基氯树脂于固相合成管中，加入5～8倍体积的二氯甲烷使树脂充分溶胀后挤出溶剂；2)称取Fmoc-Val-OH于20mL的小瓶中，依次加入DIEA、适量(约10～15mL)二氯甲烷使氨基酸充分溶解后用吸管转移至步骤1)中的固相合成管中，室温下振荡反应1小时；其中，Fmoc-Val-OH与DIEA的摩尔质量比是1:2；3)挤出步骤2)中的反应液，用二氯甲烷洗涤，加入10～15mL封端液封闭树脂上未反应的活性氯原子，其中封端液的配比为二氯甲烷：甲醇：DIEA＝17：2：1；4)封闭15～30分钟后，挤出反应液，用二氯甲烷洗涤，再用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤，之后加入10～15mL体积比为20％的哌啶反应30min脱除第一个氨基酸上的Fmoc保护基使之裸露出活性氨基；5)挤出步骤4)中的反应液，DMF洗涤；6)称取Fmoc-Ser(tBu)-OH及HBTU于20mL的小瓶中，加入DIEA，加入适量(约10～15mL)DMF使氨基酸充分溶解后用吸管转移至固相合成管中，室温下振荡反应2小时；其中，Fmoc-Ser(tBu)-OH、HBTU与DIEA的用量比为1:1:2；7)反应完成后，挤出步骤6)中的反应液，DMF洗涤，加入10～15mL体积比为20％哌啶反应30min，反应结束后再用DMF洗涤；8)重复上述6)-7)的步骤，按顺序依次加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH直至最后的萘乙酸，每个氨基酸的用量均是第一个氨基酸的2～3倍；9)待肽链全部完成后，挤出反应液，用DMF洗涤后再用二氯甲烷洗涤，加入5～10mL三氟乙酸、水以及三异丙基硅烷(三者的体积比为95％：2.5％：2.5％)的混合液反应30～60min将多肽从树脂上切下来；10)收集多肽切割液于100mL的圆底烧瓶中，真空减压旋转浓缩除去三氟乙酸，加入10～20mL无水乙醚使多肽粗品析出，静置后轻轻弃去上面的无水乙醚，真空泵将多肽粗品抽干后于-20℃保存待纯化。本专利技术更进一步公开了含酪丝缬肽(YSV)并基于D构型短肽自组装的新型抗癌超分子水凝胶在制备增强抗癌活性药物方面的应用；所述的增强抗癌活性指的是在体内、体外能显著增强YSV的抗癌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含酪丝缬肽(YSV)并基于D构型短肽自组装的抗癌超分子水凝胶，其特征在于：它是将抗癌短肽YSV共价修饰到成胶因子NapGDFDFDY的C末端，利用多肽Fmoc固相合成法合成目的多肽；经过反相高效液相色谱分离纯化后得到纯度大于95％的目的产物NapGDFDFDYGYSV，该产物能够以大于1mg/mL的浓度在PBS中经加热‑冷却形成肉眼可见的水凝胶。

【技术特征摘要】
1.一种含酪丝缬肽(YSV)并基于D构型短肽自组装的抗癌超分子水凝胶，其特征在于：它是将抗癌短肽YSV共价修饰到成胶因子NapGDFDFDY的C末端，利用多肽Fmoc固相合成法合成目的多肽；经过反相高效液相色谱分离纯化后得到纯度大于95％的目的产物NapGDFDFDYGYSV，该产物能够以大于1mg/mL的浓度在PBS中经加热-冷却形成肉眼可见的水凝胶。2.一种权利要求1所述含酪丝缬肽(YSV)并基于D构型短肽自组装的抗癌超分子水凝胶的制备方法，其特征在于步骤如下：1)将固相合成得到的NapGDFDFDYGYSV粗品溶于DMSO，溶解后过0.25μm有机滤膜，过滤后的样品使用反相高效液相色谱进行分离纯化，收集目的产物峰，将收集得到的产物溶液进行真空减压旋转浓缩，除去甲醇后加入超纯水于-80℃冰箱冷冻，经冷冻干燥后得到白色粉末状多肽纯品；2)将多肽纯品溶于PBS中，并用碳酸钠调节pH至7.0～7.4，配置成终浓度大于1mg/mL的溶液；使用移液枪吸取100～500μL样品溶液于玻璃小瓶中，加热至样品完全溶解后，静置于桌面上冷却，5～10分钟内即可形成宏观可见的水凝胶。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述NapGDFDFDYGYSV粗品的固相合成步骤如下：1)称取0.5～1g三苯基甲基氯树脂于固相合成管中，加入5～8倍体积的二氯甲烷使树脂充分溶胀后挤出溶剂；2)称取Fmoc-Val-OH于20mL的小瓶中，依次加入DIEA、适量二氯甲烷使氨基酸充分溶解后用吸管转移至步骤1)中的固相合成管中，室温下振荡反应1小时；其中，Fmoc-Val-OH与DIEA的摩尔质量比是1:2；3)挤出步骤2)中的反应液，用二氯甲烷洗涤，加入10～15mL封端液封闭树脂上未反应的活性氯原子，其中封端液的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鉴峰，任春华，刘金剑，张玉民，杨翠红，杨丽军，黄帆，高阳，
申请(专利权)人：中国医学科学院放射医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12