生色过氧化物酶底物制造技术

本申请描述了用于基于颜色检测靶标的生色缀合物。缀合物包括生色部分例如罗丹明，对甲氨基酚或荧光素。生色部分连接于过氧化物酶底物。生色缀合物可以用于免疫组织化学分析和原位杂交。缀合物可以用于通过颜色检测样品中的1个、2个、3个或更多个靶标。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生色过氧化物酶底物相关申请的交叉引用本申请要求2015年12月18日提交的美国临时申请62/269,575的申请日的权益和优先权权利。
本申请涉及生色缀合物，生色分析的方法例如免疫组织化学(IHC)和色原体原位杂交(CISH)，和制备生色缀合物的方法。
技术介绍
当在显微镜载玻片上分析组织样品时，用有色染料将组织或组织的某些部分染色可以有助于分析。可视化或差异性识别显微结构的能力常常通过使用组织学染剂来增强。苏木素和伊红(H&E)染剂是组织学样品的光学显微镜法中最常使用的染剂。苏木素用于将细胞核染成蓝色，伊红将细胞质和细胞外结缔组织基质染成粉色。除了H&E染剂之外，其它染剂或染料已经应用于提供更具特异性的染色以及提供组织形态学的更详细视图。免疫组织化学(IHC)染剂具有大的特异性，因为它们使用用于IHC染色的过氧化物酶底物或碱性磷酸酶(AP)底物，提供均匀的染色图案，其向观察者显现为具有细胞结构(例如细胞膜，细胞质，和细胞核)的细胞内分辨率的均匀颜色。福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品、中期分裂相或组织学涂片通常通过在载玻片上染色分析，其中特定的生物标志物例如有用的蛋白质或核酸可以用H&E和/或有色染料染色，下文称为"色原体"或"生色部分"。IHC染色是评价组织样品存在特异性生物标志物的常用工具。IHC染剂可精确地识别整个样品中的特异性靶标并允许定量化这些靶标。IHC染色使用在组织学样品标记靶标的生色和/或荧光报告物。这通过将生物标志物直接或间接与酶(通常为辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)的任一者)连接来进行，其随后催化在来自可溶的适宜酶底物的生物标志物(其表示出颜色)的位置催化不溶性有色沉淀物的形成。在印迹/捕获测定中，将生物标志物从其原始位置提取到溶液中，然后重新固定在膜、凝胶、或芯片阵列上，但是生物标志物也用可见的颜色(色原体)染色，通常通过同一HRP或AP酶的作用进行。与其它检测技术例如辐射能、化学发光或荧光相比，色原体通常具有远远较低的敏感性，但是具有的优点是永久、清楚可见的颜色，其可在视觉上观察，例如用明视场显微镜法进行观察。基于酶的生色检测固定在固体载体上或固定到固体载体中的固体生物样品或靶标中的靶标的其它限制包括：可用于靶标染色的生色HRP和AP底物的数目非常有限，这限制了使用这些靶标可视化系统来检测样品中的多个靶标。同样，一些色原体如HRP底物3,3'-二氨基联苯胺(DAB)不是特征在于界限清楚的光谱特征，而是不溶的吸收光的棕色沉淀物。此外，当涉及多个靶标的可视化时，其通常需要去使用多个基于酶的可视化系统的组合，例如HRP和AP。这些限制使得样品染色过程复杂、鲁棒性较小且昂贵，并且也使自动检测靶标和图像分析染色样品变得复杂。罗丹明、对甲氨基酚和荧光素是强烈有色和荧光的。根据卤化和/或取代类型，它们几乎有任何颜色。它们已经已知了一个多世纪，并且几种用作专用染剂，其无需任何酶活性即可将组织样品染色。例如，罗丹明110用作线粒体染剂，为四溴荧光素，也称为伊红，广泛用于苏木素/伊红(H和E)双染剂，其中苏木素将细胞核染成蓝色，伊红将任何蛋白质基本上染成粉色或红色。因此尽管这些化合物的衍生物由于它们独特和明亮的颜色而作为潜在色原体似乎具有吸引力，但是非特异性组织染色，甚至在不存在任何酶活性的情况下，对于它们用作色原体是一个阻碍。另一个阻碍是提供在含水环境中具有适宜溶解度的衍生物。罗丹明和荧光素化合物也是稳定的并且需要强制条件以进行进一步的反应。解决方案是在荧光素异硫氰酸酯("FITC")和四甲基罗丹明异硫氰酸酯("TRITC")或羧基荧光素和磺基罗丹明中引入额外的反应性基团，例如异硫氰酸酯。但是，增加这些反应性基团不容易做到并且得到两种最不可分离的异构体的混合物。FITC已经变得与反应性荧光素广泛关联，是用于制备抗体和核酸探针的荧光素衍生物的已证实的方法。但是，这样的衍生物是昂贵的，一些是令人望而却步地昂贵。在过去十年中，在罗丹明和荧光素2'-酯衍生物的领域内已经取得了进展。参见，例如，Beija，Marianaetal.，"SynthesisandapplicationsofRhodaminederivativesasfluorescentprobes."Chem.Soc.Rev.，2009，38，2410-2433；Afonso，A.M.Carlos，etal.，"AnExpedientSynthesisofCationicRhodamineFluorescentProbesSuitableforConjugationtoAminoAcidsandPeptides."Synthesis，2003，17，2647-2654；XiChenetal.，"AnefficientandversatileapproachforthepreparationofarhodamineBesterbioprobelibrary."DyesandPigments2012，94，296-303。罗丹明和荧光素都具有2'羧酸，其可以在某些条件下衍生化为酯或酰胺。但是，罗丹明或荧光素的2'伯酰胺"折叠"成无色的螺内酰胺或螺内酯互变异构体，使得这些衍生物不适于用作色原体。酯和伯胺的酰胺不经历该互变异构化，因为它们缺少不稳定的N-H质子。已经报告了制备罗丹明和荧光素的仲胺哌嗪的酰胺的方法。参见NguyenT.etal.，"Practicalsyntheticroutetorhodaminedyes"，Org.Lett.2003,18，3245-48；Huang，Chusem，etal.；"VersatileProbesfortheSelectiveDetectionofVicinal-Dithiol-Containingproteins:Design，Syntheses，andApplicationsinLivingCells".Chem.Eur.J.2013，19,7739-7747。荧光素异硫氰酸酯(FITC)是很多利用荧光的应用例如流式细胞仪中使用的荧光素的衍生物。FITC包括荧光素分子在其4’位用结构的单环苯基上的异硫氰酸酯反应性基团(-N＝C＝S)官能化。该衍生物对蛋白质上包括胺和巯基基团的亲核物质具有反应性。最近已经描述了在靶标的组织化学检测中使用荧光素作为HRP底物的可检测部分。Lohse的WO2007/015168涉及单体或聚合物连接基分子用于生物和化学应用、它们的合成、以及缀合于各种可检测标记和其它物质的连接基的衍生物的合成和使用。连接基可以用于例如与荧光标记、核酸或核酸类似物探针、和固相系统联用，并且用于增强缀合的分子的溶解性。WO2009/036760、WO2010/094283、WO2010/094284、WO2011/047680和WO2012/143010涉及HRP底物经WO2007/015168的连接基在其4’位缀合于荧光素。后一种缀合物是无色但是荧光的，并且可以或用于靶标的直接荧光检测或用于靶标的间接组织化学检测：缀合物经酶反应沉积在标记有HRP活性的靶标位点，然后可以将沉积的缀合物或作为荧光染剂进行光学检测或作为半抗原进行免疫化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生色缀合物，其包含：(a)生色部分，和(b)过氧化物酶底物部分，其中所述生色部分和所述过氧化物酶底物部分经连接基连接在一起，其中所述缀合物为式I化合物：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.18 US 62/269,5751.一种生色缀合物，其包含：(a)生色部分，和(b)过氧化物酶底物部分，其中所述生色部分和所述过氧化物酶底物部分经连接基连接在一起，其中所述缀合物为式I化合物：其中X是-OH，-ORX或-NRXRXX，其中Y是＝O或＝N+RYRYY；其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢和具有小于40个原子的取代基；L是包含5至29个连续连接原子的直链的连接基；和PS是过氧化物酶底物部分，其中所述过氧化物酶底物部分具有下式：其中R21是-H，R22是-H，-O-X，或-N(X)2；R23是-OH；R24是-H，-O-X，或-N(X)2；R25是-H，-O-X，或-N(X)2；R26是-CON-(X)2，-CONH(X)，或-COO(X)；其中H是氢；O是氧；N是氮；X是H，烷基或芳基。2.权利要求1的生色缀合物，其中R1选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R1可以与R2一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团；R2选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R2可以与R1一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团，或者，当X是-NRXRXX时，R2可以与RX一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；RX当存在时选自氢，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RX可以与R2一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；RXX当存在时选自任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RXX可以与R3一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；R3选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，当X是-NRXRXX时，R3可以与RXX一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；R4选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，当Y是-N+RYRYY时，R4可以与Ryy一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；Ryy当存在时选自任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者Ryy可以与R4一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；RY当存在时选自氢，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RY可以与R5一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；RYY当存在时选自任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RXX可以与R6一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；R5选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R5可以与R6一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团，或者，当Y是-N+RYRYY时，R5可以与Ry一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；R6选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R6可以与R5一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团；R7、R8和R9各自彼此独立地选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基；R10选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，卤素，卤代烷基，-OR12，-SR12，-SOR12，-SO2R12，和腈；R11选自-NR15R15，-OR16，-SR16，卤素，卤代烷基，-CN，-NC，-OCN，-SCN，-NO，-NO2，-N3，-S(O)R16，-S(O)2R16，-S(O)2OR16，-S(O)NR15R15，-S(O)2NR15R15，-OS(O)R16，-OS(O)2R16，-OS(O)2NR15R15，-OP(O)2R16，-OP(O)3R16R16，-P(O)3R16R16，-C(O)R16，-C(O)OR16，-C(O)NR15R15，-C(NH)NR15R15，-OC(O)R16，-...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·P·M·汉森，J·洛斯，
申请(专利权)人：丹麦科达有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK