一种BBS7缺失突变体的构建方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种BBS7缺失突变体构建方法和应用。本发明专利技术所述方法所构建的BBS7缺失突变体对BBS7敲除的293T细胞进行转染，转染48h后用流式分选出转染成功的细胞，并与野生型细胞对比，进一步研究BBS7缺失突变体和正常细胞相比在DNA、RNA以及蛋白质水平和细胞功能状态等方面有什么不同，以进一步了解BBS7缺失突变体的生命学功能特征，进而了解BBS的致病机制，为BBS患者的治疗提供更多的思路；具有极大的市场前景和经济价值。

Construction method and application of a BBS7 deletion mutant

The invention belongs to the biotechnology field, in particular to a construction method and application of BBS7 deletion mutant. The BBS7 deletion mutant constructed by the present method was used to transfect the BBS7 knockout 293T cells. After transfection of 48h, the transfected cells were selected by flow cytometry, and compared with the wild type cells, the BBS7 deletion mutants were further studied in the aspects of DNA, RNA, egg white quality and cell functional status compared with normal cells. What is the difference, in order to further understand the functional characteristics of the BBS7 deletion mutants, and then understand the pathogenesis of BBS, provide more ideas for the treatment of BBS patients, and have great market prospects and economic value.

【技术实现步骤摘要】
一种BBS7缺失突变体的构建方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种BBS7缺失突变体及其构建方法和应用。
技术介绍
巴德-毕氏综合征(Bardet-BiedlSyndrome，BBS)是一种罕见的纤毛相关性遗传疾病，其主要特症包括肥胖、视网膜色素变性、多指(趾)畸形、智力缺陷和肾异常等，次要特征包括糖尿病、心脏畸形、高血压、发育迟缓、听力损失等。这些表型的多样性，均与纤毛维护和胞内运输的缺陷有关。迄今已发现21种致病BBS基因(BBS1-21)，但其编码蛋白质的功能及作用机制尚未完全明了。其中，8种BBS基因编码蛋白(BBS1，BBS2，BBS4，BBS5，BBS7，BBS8，BBS9及BBS18)形成一个复杂而稳定的蛋白复合体(BBSome)，这种蛋白复合体介导蛋白质转运到纤毛的膜结构上并参与其结构的构建和功能的发挥，其中，BBS7既是BBSome(BBS1，BBS2，BBS4，BBS5，BBS7，BBS8，BBS9及BBS18)的一个独立亚基，同时也和BBS的分子伴侣复合物直接结合，参与相关的调控活动。本申请的专利技术人前期采用基因表达谱芯片对巴德-毕氏综合征患者外周血单个核细胞差异基因表达进行了研究。通过采集3例BBS先证者及4名年龄、性别匹配的健康对照者静脉血，分离外周血单个核细胞，用Trizol一步法提取总RNA并进行扩增和标记，然后与AffymetrixU133Plus2.0芯片进行杂交，扫描芯片并将图像信号转化为数字信号，GCOS1.4软件读取、处理数据。将患者与正常对照基因表达谱进行比较。在54614个基因表达谱的筛选中，BBS患者与正常对照相比，有l821个基因表达水平有统计学上的显著差异(P<0.O5)。其中991个基因为表达上调，830个基因为表达下调。在差异表达基因中，表达量大于等于2倍差异的基因共30个，含10个功能未知基因。已报到的研究中，利用基因敲除手段构建了基因型为BBS7-/-的小鼠，发现缺少BBS7基因造成小鼠在出生前意外死亡，最终造成比例降低。还发现小鼠和人类在表型上存在一定差异，提示BBS7相关的遗传疾病在物种间存在着一定差异；缺少BBS7可造成纤毛结构的异常，从而在生理方面对小鼠发育造成影响，类似的也发现BBS7通过影响纤毛结构与性腺功能的发育有一定关系；BBS7和pk2的缺陷会对KV及其纤毛长度有影响，但是二者不是协同作用，当BBS7和pk2同时存在缺陷时，pk2的缺陷反而会减少BBS7缺陷造成的影响，即二者在某些特定的胞内运输过程中有间接相互的作用；Arends等发现在肥胖小鼠特有的基因映射区域包含了4组基因，其中BBS7位列其中。另一方面，不同研究者对BBS7的表型以及变异表型做病例分析发现：BBS表型不仅受到DNA突变水平的影响，还会受到相关蛋白的缺陷或是甲基化的影响；BBS7突变导致一个丝氨酸变成了精氨酸，致使蛋白变性，引起疾病；BBS7突变引起了锥-杆细胞的营养不良，造成中间或周围的视野消失或模糊，近亲婚育叠加遗传给后代，最终致盲率超过70％。此外，通过对中心粒的荧光免疫染色研究发现，未注射-可沉默相关蛋白活性的吗啉代低聚核苷酸(morpholinooligonucleotide，MO)的斑马鱼的神经管居中排列，十分规律。而单独注射BBS7-MO的斑马鱼的神经管排列分散，没有规律，提示BBS7缺陷会对神经系统造成影响。已有多项研究表明BBS7突变会导致多种生理功能障碍，并对机体的基本生命活动造成影响。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有技术BBS7缺失突变体构建的技术空白，从而提出一种BBS7缺失突变体的构建方法及其应用领域。为解决上述技术问题，本专利技术公开了一种BBS7缺失突变体的构建方法，所述构建方法为：A.用定点诱变(DpnI)法进行定点突变，缺失体扩增引物为B7delF:5’tgcaagttacatctatacattattgtgactgcaaagacca3’和B7delR:5’tggtctttgcagtcacaataatgtatagatgtaacttgca3’；以野生型BBS7质粒DNA为模板，利用上述引物行体外PCR扩增；B.酶切去除野生型将PCR扩增产物放入酶切混合体系，进行水浴处理，随后进行热干浴处理，得到酶切去除野生型后的产物；所述酶切体系条件如下：ddH2O为0.5μl；乙酰化牛血清白蛋白为0.5μl；PCR产物为48μl；DpnI为1μl；C.进行细胞转化将感受态细胞置于于冰上融化后，加入3μl酶切去除野生型后的产物，混匀置于冰上25min；再在35-50℃的温度下进行水浴热激，然后取出置于冰上冷却，加入700μl的无菌LB液体培养基，混匀后，置于在200rpm的摇床上复苏1h；然后在5000rpm的速度离心1min,弃去500μl上清液体，并混匀沉淀，得到转化混合物；取两个加了卡那霉素的LB琼脂平板，分别涂布50μl、60μl的转化混合物，对照组涂布未转化的感受态细胞，涂布均匀进行恒温培养；D.质粒提取：随机挑取含卡那霉素的LB琼脂平板上的克隆进行质粒DNA提取；E.提取的质粒DNA进行双酶切处理，将加入了质粒的双酶切混合溶液进行30-40℃水浴处理，随后置于50-70℃进行热干浴处理，得到酶切纯化后的片段；所述双酶切混合溶液中：10×M缓冲液2μl；KpnI0.6μl；XhoI0.6μl；目的DNA10μl；DDH2O6.8μl；F.取酶切纯化后片段5μl，加入T4DNA连接酶0.5μl、10×T4连接缓冲液2μl、载体0.5μl及DDH2O2μl混合，将以上10μl混合物置于10-20℃,完成连接反应，然后取6μl的连接产物转化50μl的感受态细胞；G.再次进行细胞转化处理，转化方式与所述步骤C相同；H.再次进行质粒提取处理，提取方式与所述步骤D相同，获得所述突变体。优选的，所述步骤D的具体步骤如下：1)取两个单克隆于含有4ml液体LB培养基的试管中，37℃摇床培养14-16h；2)用质粒制备试剂盒提取质粒；取1ml上述菌液加入标记好的ep管中，10000rpm离心2min,收集菌体，并尽可能吸去上层培养基；3)向ep管中加入250μl的RNaseA缓冲液,反复充分悬浮细菌细胞，直到将细菌细胞团完全吹散；4)加入250μl缓冲液B1，反转ep管6-15次使缓冲液与细菌细胞充分混合均匀，静置5min致溶液粘稠而且澄清；5)加入350μl缓冲液N1，充分混匀；6)将离心机调至高速状态，室温13000rpm离心10min；7)吸取离心后的上层清液至已放入DNA吸附柱的收集管中，室温13000rpm离心1min；8)向DNA吸附柱中加入500μl缓冲液KB，室温13000rpm离心1min；9)向离心柱中加入500μl含有无水乙醇的DNA清洗液，室温13000rpm离心1min；10)再次向离心柱中加入500μl含有无水乙醇的DNA清洗液，室温13000rpm离心1min；11)再次室温13000rpm离心1min；12)将离心柱转到一个新的1.5ml的ep管中，向DNA柱的中间位置加入60μlDNA洗脱液，室温放置两分钟，13000rpm离心1min以洗脱DNA，取出ep管将洗脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种BBS7缺失突变体的构建方法，其特征在于，所述构建方法为：A.用定点诱变法进行定点突变，引物序列为B7delF:5’tgcaagttacatct atacattattgtgactgcaaagacca3’和B7delR:5’tggtctttgcagtcacaataatgta tagatgtaacttgca3’；用该对引物对BBS7野生型质粒DNA为模板进行体外P CR扩增；B.酶切去除野生型将PCR扩增产物放入酶切混合体系，进行水浴处理，随后进行热干浴处理，得到酶切去除野生型后的产物；所述酶切体系条件如下：ddH2O为0.5μl；乙酰化牛血清白蛋白为0.5μl；PCR产物为48μl；DpnI为1μl；C.进行细胞转化将感受态细胞置于于冰上融化后，加入3μl酶切去除野生型后的产物，混匀置于冰上25min；再在35‑50℃的温度下进行水浴热激，然后取出置于冰上冷却，加入700μl的无菌LB液体培养基，混匀后，置于在200rpm的摇床上复苏1h；然后在5000rpm的速度离心1min,弃去500μl上清液体，并混匀沉淀，得到转化混合物；取两个加了卡那霉素的LB琼脂平板，分别涂布50μl、60μl的转化混合物，对照组涂布未转化的感受态细胞，涂布均匀进行恒温培养；D.质粒提取：随机挑取含卡那霉素的LB琼脂平板上的克隆进行质粒提取，得到质粒DNA；E.提取的质粒DNA进行双酶切处理，将加入了质粒的双酶切混合溶液进行30‑40℃水浴处理，随后置于50‑70℃进行热干浴处理，胶回收酶切后的片段；所述双酶切混合溶液中：10×M缓冲液2μl；KpnI 0.6μl；XhoI 0.6μl；目的DNA 10μl；DDH2O 6.8μl；F.取酶切纯化后片段5μl，加入T4 DNA连接酶0.5μl、10×T4连接缓冲液2μl、载体0.5μl及DDH2O 2μl混合，将以上10μl混合物置于10‑20℃,完成连接反应，然后取6μl的连接产物转化50μl的感受态细胞；G.再次进行细胞转化处理，转化方式与所述步骤C相同；H.再次进行质粒提取处理，提取方式与所述步骤D相同，获得所述突变体。...

【技术特征摘要】
1.一种BBS7缺失突变体的构建方法，其特征在于，所述构建方法为：A.用定点诱变法进行定点突变，引物序列为B7delF:5’tgcaagttacatctatacattattgtgactgcaaagacca3’和B7delR:5’tggtctttgcagtcacaataatgtatagatgtaacttgca3’；用该对引物对BBS7野生型质粒DNA为模板进行体外PCR扩增；B.酶切去除野生型将PCR扩增产物放入酶切混合体系，进行水浴处理，随后进行热干浴处理，得到酶切去除野生型后的产物；所述酶切体系条件如下：ddH2O为0.5μl；乙酰化牛血清白蛋白为0.5μl；PCR产物为48μl；DpnI为1μl；C.进行细胞转化将感受态细胞置于于冰上融化后，加入3μl酶切去除野生型后的产物，混匀置于冰上25min；再在35-50℃的温度下进行水浴热激，然后取出置于冰上冷却，加入700μl的无菌LB液体培养基，混匀后，置于在200rpm的摇床上复苏1h；然后在5000rpm的速度离心1min,弃去500μl上清液体，并混匀沉淀，得到转化混合物；取两个加了卡那霉素的LB琼脂平板，分别涂布50μl、60μl的转化混合物，对照组涂布未转化的感受态细胞，涂布均匀进行恒温培养；D.质粒提取：随机挑取含卡那霉素的LB琼脂平板上的克隆进行质粒提取，得到质粒DNA；E.提取的质粒DNA进行双酶切处理，将加入了质粒的双酶切混合溶液进行30-40℃水浴处理，随后置于50-70℃进行热干浴处理，胶回收酶切后的片段；所述双酶切混合溶液中：10×M缓冲液2μl；KpnI0.6μl；XhoI0.6μl；目的DNA10μl；DDH2O6.8μl；F.取酶切纯化后片段5μl，加入T4DNA连接酶0.5μl、10×T4连接缓冲液2μl、载体0.5μl及DDH2O2μl混合，将以上10μl混合物置于10-20℃,完成连接反应，然后取6μl的连接产物转化50μl的感受态细胞；G.再次进行细胞转化处理，转化方式与所述步骤C相同；H.再次进行质粒提取处理，提取方式与所述步骤D相同，获得所述突变体。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤D的具体步骤如下：1)取两个单克隆于含有4ml液体LB培养基的试管中，37℃摇床培养1...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈涛，
申请(专利权)人：沈涛，
类型：发明
国别省市：云南,53