本发明专利技术公开了一种含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒、基因工程菌及其应用。该重组质粒通过将人巨细胞病毒的UL146基因插入大肠杆菌克隆表达载体pET32a(+)中，获得重组载体pET32a(+)‑UL146，然后将其转化入原核表达工程菌BL21(DE3)中，获得含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌。利用该工程菌表达获得对应的UL146重组蛋白，该融合蛋白可用于制备针对HCMV UL146基因的抗体，且可以用于研究UL146基因的功能，为进一步研究UL146的功能及其分子机制提供了基础。
Recombinant plasmid, genetically engineered bacterium containing human cytomegalovirus UL146 gene and its application
The invention discloses a recombinant plasmid containing a human cytomegalovirus UL146 gene, a genetic engineering bacterium and its application. The recombinant plasmid was inserted into the pET32a (+) of the Escherichia coli clone and expression vector by inserting the UL146 gene of human cytomegalovirus (HCMV) into the recombinant vector pET32a (+) UL146, and then transformed into the prokaryotic expression engineering strain BL21 (DE3) to obtain the recombinant plasmid containing the recombinant human cytomegalovirus UL146 gene. The recombinant protein of UL146 is obtained by using the engineering bacteria. The fusion protein can be used to prepare antibodies against HCMV UL146 gene, and can be used to study the function of UL146 gene. It provides a basis for further study of the function and molecular mechanism of UL146.
【技术实现步骤摘要】
含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒、基因工程菌及其应用
本专利技术涉及生物学领域，特别涉及一种含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒、基因工程菌及其应用。
技术介绍
UL146基因是人巨细胞病毒(HCMV)中的一个开放性阅读框(ORF)，人巨细胞病毒基因组是疱疹病毒中最大的基因组，含有200多个阅读框，基因组中的大部分基因都是高度保守的，但是也存在高度多态性的基因，即其基因和核酸序列在不同病毒株之间有差异性，它们编码一些膜相关蛋白和分泌蛋白如gB、UL144、UL146及UL147基因。HCMVUL146基因长约345～360bp，UL146基因在HCMV基因组中存在于一个高度变异的区域，该区域UL146翻译的起始位点之前开始并贯穿与之毗邻的UL147的翻译起始位点，由于大多数情况下核苷酸的变化是非同义的，因此这种基因序列的变异性决定了其氨基酸序列的多态性，UL146在HCMV的各临床株中氨基酸序列高度变异，但也存在少数高度保守的氨基酸。Arav-Boger等人经过系统树分析发现UL146在不同HCMV病毒株中的变异是随机发生的，它发生在UL146整个基因中，虽然ULL146的变异在整个基因中随机发生，但是在其发生趋化因子功能区的氨基酸序列(ELR)确是高度保守的，这说明该基因对于HCMV是十分重要的。HCMVUL146的ORF约115～120个氨基酸，编码大小约13KD的小分子蛋白，Penfold等人通过序列比对分析及趋化性实验发现来源于Toledo的趋化因子vCXCL-1与宿主细胞因子白细胞介素-8(IL-8)序列类似，且具有趋化因子的特征性结构如信号肽、Cys残基及趋化因子与趋化因子受体结合及嗜中性粒细胞激活所必须的ELR基序，同时还具有趋化因子的某些功能如诱发钙流通、诱导嗜中性粒细胞的趋化性及嗜中性粒细胞的脱粒等功能，因此认为UL146编码的是一个类IL-8的病毒趋化因子，它是第一个被发现的病毒α趋化因子vCXCL-1。趋化因子是一群参与免疫调控的小分子蛋白，可吸引白细胞到达感染部位。根据其结构的不同，将其分为四类：C,CC,CXC和CX3C。HCMV可通过与趋化因子结合或表达趋化因子类类似物蛋白抑制其功能。例如：US28通过与CC趋化因子结合抑制宿主的免疫应答；UL128是五聚体复合物((gH/gL/UL128-UL130-UL131A)中的一员，编码一种CC趋化因子而影响组织嗜性。vCXCL-1由具有高度多态性的HCMVUL146基因编码，且这种变异大多是错义突变，因此不同HCMV病毒株的vCXCL-1具有差异性。Heo等人进行研究发现不同的vCXCL-1其功能如引发嗜中性粒细胞的迁移，与嗜中性粒细胞表面受体结合的亲和力及vCXCL-1对信号通路的响应等有所差异，说明vCXCL-1的多态性影响了vCXCL-1与受体结合的亲和力及嗜中性粒细胞的激活。CXCR1与CXCR2受体均可在嗜中性粒细胞表面表达，是常见的趋化因子受体，二者氨基酸序列有77％同一性，Lu¨ttichau研究发现vCXCL-1不仅可以与CXCR2结合还可与CXCR1结合并引发嗜中性粒细胞的迁移，但是与CXCR1结合的亲和力较低。Yamin等人经过研究发现vCXCL-1不仅可以与CXCR1和CXCR2结合，还能与自然杀伤(NK)细胞表面表达的CX3CR1结合，且能通过与CXCR2结合优先吸引嗜中性粒细胞而不是在免疫过程中起重要作用的NK细胞。以上研究都表明HCMVUL146基因对于HCMV的在体内的扩散及传播有着十分重要的作用，所以进一步研究UL146作用的分子机制是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒。本专利技术的另一目的在于提供含有上述人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌。本专利技术的又一目的在于提供上述含有巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒，含有UL146基因片段，其中，UL146基因片段的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。所述的含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒的构建方法，通过常规方法将UL146基因片段插入到pET32a(+)载体中获得。一种含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌，转化有上述含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒。所述的基因工程菌优选为大肠杆菌；更优选为大肠杆菌DH5α或BL21(DE3)。所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌的构建方法，将上述含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒转化入原核表达工程菌中，得到含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌；其构建方法优选为包括如下步骤：(1)以HCMVBACTowne文库作为模板设计针对UL146基因的引物序列，引入SalI和BamHI两个酶切位点；(2)以HCMVBACTowne文库为模板PCR扩增UL146基因；(3)对步骤(2)中扩增得到的UL146基因进行电泳并回收UL146DNA；(4)将步骤(3)中回收的UL146DNA和载体质粒pET32a(+)进行SalI和BamHI双酶切，并进行纯化；(5)将步骤(4)中纯化后的产物进行连接，使UL146目的基因和载体质粒pET32a(+)相连接；(6)将(5)中连接后的产物转化大肠杆菌感受态细胞中，得到含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌。步骤(3)中所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳。所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌的构建方法，在步骤(5)之后还包括所得到的重组质粒进行双酶切鉴定阳性克隆并测序的步骤。所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌在UL146重组蛋白制备中的应用。一种UL146重组蛋白的制备方法，将上述含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌经过活化培养和发酵培养，再加入诱导剂IPTG进行诱导表达，得到UL146重组蛋白；优选为：将上述工程菌接种至含有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB液体培养基中进行活化培养，然后转接到含有氨苄青霉素抗性LB液体培养基中进行发酵培养，再加入诱导剂IPTG进行诱导表达，得到UL146重组蛋白。所述的诱导表达的条件优选为：在20℃诱导10h。所述的IPTG的工作浓度为0.5mM。所述的UL146重组蛋白的制备方法，还包括将获得的UL146重组蛋白进行纯化的步骤。所述的纯化为采用镍柱亲和层析进行纯化，组氨酸标签是纯化标签。所述的UL146重组蛋白的制备方法，还包括将获得的UL146重组蛋白进行定量的步骤：采用BCA法进行蛋白定量。所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌在制备人巨细胞病毒UL146蛋白多克隆抗体中的应用；该工程菌可以表达出带有组氨酸标签的融合蛋白，可应用亲和层析纯化制备多克隆抗体。所述的重组蛋白含6×His组氨酸标签。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本专利技术的目的是构建一种含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒工程菌，用于研究HCMV扩散和传播的分子机制，为HCMV治疗靶点提供基础。2、本专利技术提供了一种包含人巨细胞病毒U本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒，其特征在于：含有UL146基因片段，其中，UL146基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒，其特征在于：含有UL146基因片段，其中，UL146基因片段的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。2.一种含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌，其特征在于：转化有权利要求1中所述的含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒。3.根据权利要求2所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌为大肠杆菌DH5α或BL21(DE3)。4.权利要求2所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌的构建方法，其特征在于：将权利要求1中所述的含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒转化入原核表达工程菌中，得到含有人巨细胞病毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱桦，何玲玲，刘奋勇，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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