一种雌激素受体靶向肽及其制备和应用制造技术

本发明专利技术提供一种雌激素受体α靶向肽，其中所述靶向肽具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：4中的34～120所示；本发明专利技术还提供了该雌激素受体α靶向肽的制备方法及其在制备雌激素受体α阳性乳腺癌药物中的应用。

An estrogen receptor targeting peptide and its preparation and Application

The present invention provides an estrogen receptor alpha targeting peptide, in which the target peptide has an amino acid sequence as shown by SEQ ID No:1, and the nucleotide sequence of the encoding gene is shown in 34~120 of the SEQ ID No:4; the invention also provides a preparation method of the estrogen receptor alpha targeting peptide and the preparation of the estrogen receptor alpha positive in the preparation of the estrogen receptor alpha peptide. The use of drugs for breast cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种雌激素受体靶向肽及其制备和应用
本专利技术涉及一种治疗肿瘤的多肽和其制备方法及应用，尤其涉及一种与雌激素受体α特异性结合的多肽及其制备方法和其在制备雌激素受体α阳性乳腺癌药物中的应用。
技术介绍
在全球女性癌症中，乳腺癌发病人数与死亡人数都位于前两位，并且发病率在逐年上升，是危害女性健康的主要杀手。约70％乳腺癌患者由于雌激素受体α(ERα)过表达，在临床上被分型为ERα阳性乳腺癌。目前针对ERα靶点设计的靶向药物主有他莫昔芬(TAM)、氟维司群(FUL)和芳香化酶抑制剂(AI)，但ERα阳性乳腺癌患者接受这些靶向药物治疗一段时间后，会产生不同程度的耐药性。现有技术中，针对ERα阳性乳腺癌的治疗方法还包括免疫疗法和基因疗法，CN201710110542.8中，采用CDK4/6抑制剂与雌激素受体拮抗剂联合治疗乳腺癌，但对免疫系统的长期抑制容易造成肝肾毒性及胚胎缺陷等；然而，目前的基因治疗虽然取得了长足的进步，但同时在治疗过程中仍会产生一些严重不良反应，如血细胞减少、心脏衰竭以及胚胎缺陷等。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的第一目的是提供一种与雌激素受体α特异性结合的多肽；本专利技术的第二目的是提供这种多肽的制备方法；本专利技术的第三目的是提供这种多肽在制备雌激素受体α阳性乳腺癌药物中的应用。技术方案：本专利技术所述的雌激素受体α靶向肽，即αⅠ-CTM，具有如SEQIDNo：1所示的氨基酸序列，具体为：Lys1Phe2Glu3Arg4Gln5Lys6Ile7Leu8Asp9Gln10Arg11Phe12Phe13Glu14Ser15Ser16Glu17Tyr18Cys19Phe20Tyr21Trp22Asp23Ser24Ala25His26Cys27Ser28Arg29；其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo：4中的34～120所示。其中，所述靶向肽还具有如SEQIDNo：2所示的氨基酸序列，即TAT，具体为：Tyr1Gly2Arg3Lys4Lys5Arg6Arg7Gln8Arg9Arg10Arg11；其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo：4中的1～33所示。优选地，将SEQIDNo：4所示的核苷酸序列克隆到表达质粒的多克隆位点处，即所述靶向肽的氨基酸序列SEQIDNo：2与氨基酸序列SEQIDNo：1通过一个肽键直接连接，所述靶向肽的，即TAT-αⅠ-CTM的，氨基酸序列如SEQIDNo：3所示，具体为：Tyr1Gly2Arg3Lys4Lys5Arg6Arg7Gln8Arg9Arg10Arg11Lys12Phe13Glu14Arg15Gln16Lys17Ile18Leu19Asp20Gln21Arg22Phe23Phe24Glu25Ser26Ser27Glu28Tyr29Cys30Phe31Tyr32Trp33Asp34Ser35Ala36His37Cys38Ser39Arg40。所述雌激素受体α靶向肽的编码基因的表达载体，其包含上述的核苷酸序列SEQIDNo：4。所述雌激素受体α靶向肽的编码基因的宿主细胞，其表达上述雌激素受体α靶向肽。所述具有氨基酸序列SEQIDNo：1和SEQIDNo：2的雌激素受体α靶向肽的制备方法，包括如下步骤：(1)第一结构域的质粒构建：合成第一结构域的两条单核苷酸链，其中，正向序列如SEQIDNo：5所示、反向序列如SEQIDNo：6所示，再与特异性BamHI和EcoRI双酶切的pET-22b载体进行连接反应，得到pET-22b-A载体(即pET-22b-TAT质粒)；(2)第二结构域的质粒构建：合成第二结构域的两条单核苷酸链，其中，正向序列如SEQIDNo：7所示、反向序列如SEQIDNo：8所示，再与步骤(1)中得到的特异性SalI和NotI双酶切的pET-22b-A载体进行连接反应，得到pET-22b-A-B载体(即pET-22b-TAT-CTM质粒)；(3)第三结构域的质粒构建：合成第三结构域的两条单核苷酸链，其中，正向序列如SEQIDNo：9所示、反向序列如SEQIDNo：10所示，再与步骤(1)中得到的特异性SalI和NotI双酶切的pET-22b-A-B载体进行连接反应，得到pET-22b-A-B-C质粒(即pET-22b-TAT-αI-CTM质粒)；(4)将步骤(3)中得到的pET-22b-A-B-C质粒转入到感受态大肠杆菌DH5α，提取质粒并测序；(5)将步骤(4)中测序正确的质粒转入感受态大肠杆菌DE3，进行蛋白表达并纯化，得到所述雌激素受体α靶向肽。具有氨基酸序列SEQIDNo：1或具有SEQIDNo：1和2的雌激素受体α靶向肽在制备雌激素受体α阳性乳腺癌药物中的应用。有益效果：本专利技术与现有技术相比，其显著优点为：短肽αI能够与ERα直接作用并且特异性结合；体外合成的ERα靶向肽αI-CTM能靶向使细胞内的ERα蛋白通过CMA途径被溶酶体降解；从而影响细胞的活力和周期，转入αI-CTM-RFP的MCF-7细胞活力要比转入CTM-RFP的下降了6.1％，同时导致细胞G0/G1期阻滞；同时，体外合成的ERα靶向肽TAT-αI-CTM不仅能够降低细胞中ERα蛋白水平，并且随着靶向肽剂量的增加，乳腺癌MCF-7细胞的增殖受到明显的抑制，细胞活力下降约24.3％。为制备雌激素受体α阳性乳腺癌药物提供了新的途径。附图说明图1A为293T细胞中αI与ERα特异性结合的GSTpull-down实验的WesternBloting结果图；图1B为MCF-7和T47D细胞中αI与ERα特异性结合的GSTpull-down实验的WesternBloting结果图；图2A为ERα靶向肽αI-CTM降解ERα阳性乳腺癌细胞MCF-7中ERα蛋白表达水平的WesternBloting结果图；图2B为ERα靶向肽αI-CTM对MCF-7细胞中ERα的mRNA水平影响的real-timePCR结果图；图3A为流式细胞仪检测ERα靶向肽αI-CTM对MCF-7细胞周期影响的实验结果图；图3B为CCK8试剂盒检测ERα靶向肽αI-CTM抑制MCF-7细胞增殖的影响结果图；图4A为靶向肽TAT-αI-CTM对ERα阳性乳腺癌细胞MCF-7中ERα蛋白表达水平的WesternBloting结果图；图4B为CCK8试剂盒检测合成靶向肽TAT-αI-CTM抑制MCF-7细胞增殖的影响结果图；图5为合成的ERα靶向肽TAT-αI-CTM的高效液相色谱和质谱检测结果图。具体实施方式以下结合附图和实施例对本专利技术的技术方案作进一步地说明。本专利技术所用生物材料、载体、菌株、试剂和试剂盒等均可以通过常规商业购买获得，其中涉及的生物基因工程操作技术，如质粒提取、酶切消化、片段回收、核酸片段与质粒载体连接反应及克隆和筛选等，均为本领域内的常规操作或参照相应商品的说明书进行操作。本专利技术所用生物材料、载体、菌株的来源或型号如下：293T细胞为293T(CRL-3216TM)；MCF-7细胞为MCF-7(HTB-22TM)；T47D细胞为T47D(HTB-133TM)；DH5α和BL21(DE3)菌株购自上海唯地生物技术有限公司；pEGFP-N2、pET-22b和pGEX-6P-1质粒购自生物风网站：www.biofen本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种雌激素受体α靶向肽，其特征在于：所述靶向肽具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：4中的34～120所示。

【技术特征摘要】
1.一种雌激素受体α靶向肽，其特征在于：所述靶向肽具有如SEQIDNo：1所示的氨基酸序列，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo：4中的34～120所示。2.根据权利要求1所述的雌激素受体α靶向肽，其特征在于：所述靶向肽还具有如SEQIDNo：2所示的氨基酸序列，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo：4中的1～33所示。3.权利要求2所述的雌激素受体α靶向肽，其特征在于：将SEQIDNo：4所示的核苷酸序列克隆到表达质粒的多克隆位点处，即所述靶向肽的氨基酸序列SEQIDNo：2与氨基酸序列SEQIDNo：1通过一个肽键直接连接。4.权利要求1～2所述的雌激素受体α靶向肽的编码基因的表达载体，其特征在于：其包含所述的核苷酸序列SEQIDNo：4。5.权利要求1～2所述的雌激素受体α靶向肽的编码基因的宿主细胞，其特征在于：其表达所述雌激素受体α靶向肽。6.权利要求2所述的雌激素受体α靶向肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)第一结构域的质粒构建：合成第一结构域的两条单核苷酸链，其中，正向序列如SEQIDNo：5所示、反向序...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈礼明，张俊，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32