本发明专利技术涉及一种用于检测血脂代谢相关基因ABCG1甲基化的试剂盒，包括ABCG1基因甲基化检测位点引物及探针序列，如SEQ ID NO.1‑3所示；内参基因检测位点引物及探针序列，如SEQ ID NO.4‑6所示。本发明专利技术的整个检测过程采样全封闭形式，避免了交叉污染的可能。本发明专利技术试剂盒的设计及结果判读简单方便，检测结果可靠、特异性和灵敏性高，可辅助检测血脂代谢异常风险，进而提前预防。
A kit for detecting ABCG1 methylation of blood lipid metabolism related genes
The present invention relates to a kit for detecting ABCG1 methylation of blood lipid metabolism related genes, including ABCG1 gene methylation detection loci primers and probe sequences, such as SEQ ID NO.1 3; primers and probe sequences of internal reference gene detection loci, such as SEQ ID NO.4 6. The whole detection process of the invention is totally enclosed and avoids the possibility of cross contamination. The design and result interpretation of the kit is simple and convenient, the test results are reliable, specific and sensitive, and can help detect the abnormal risk of blood lipid metabolism, and then prevent it in advance.
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测血脂代谢相关基因ABCG1甲基化的试剂盒
本专利技术属于分子生物学和医学检测
，特别涉及一种用于检测血脂代谢相关基因ABCG1甲基化的试剂盒。
技术介绍
脂质代谢是人体生命活动的基本问题之一，血脂异常是一类较常见的疾病，是人体内脂蛋白的代谢异常，主要包括总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯升高和/或高密度脂蛋白胆固醇降低等。血脂异常是导致动脉粥样硬化的重要因素之一，是冠心病和缺血性脑卒中的独立危险因素。在我国血脂异常的发生率高，还有逐渐上升的趋势，这与我国人民的生活水平明显提高、饮食习惯发生改变等原因有密切关系。甲基化是核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，与人体的各种生理功能及许多疾病密切相关，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。作为最重要的表观遗传修饰之一，DNA甲基化可以通过调控特异性基因、脂肪细胞分化转录因子及转录因子的表达来影响脂肪组织的生长发育。DNA甲基化可以参与到脂肪组织生长发育以及肥胖的发生过程中，在脂肪细胞的分化机制及脂质合成过程中起着重要的调控作用。对甲基化进行检测对于了解个体的血脂代谢情况具有重大的意义，并可为相关疾病的预防和治疗提供新的方向。大量研发发现，ABCG1基因的甲基化与血脂代谢异常显著相关，因此，对ABCG1基因进行甲基化检测，能了解个体在血脂代谢方面的风险因素，评估血脂异常的发病风险，对与血脂异常的早期诊断，早期干预具有积极意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种用于检测血脂代谢相关基因ABCG1甲基化的试剂盒，涉及ABCG1基因甲基化检测，检测效率高，针对性强。本专利技术的一种用于检测血脂代谢相关基因ABCG1甲基化的试剂盒，包括：ABCG1基因甲基化检测位点引物及探针序列，如SEQIDNO.1-3所示：正向引物：5'-TGTATTGTGATATCGACGAGAC-3'，反向引物：5'-ACCTCCTCGATTCTAAACGTAC-3'，探针：5'-FAM-TTGCGGGAGTTGGACGTGG-BHQ-3'；内参基因检测位点引物及探针序列，如SEQIDNO.4-6所示：正向引物：5'-TGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3'，反向引物：5'-CAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3'，探针：5'-HEX-ACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ-3'。所述ABCG1基因甲基化检测位点为ABCG1基因的2个CpG岛。所述内参基因为Actin。所述试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品和空白对照。所述阳性质控品为全甲基化的人类基因组DNA。所述阴性质控品为非甲基化的人类基因组DNA。所述空白对照为去离子水。所述试剂盒的检测样本为外周血、唾液或口腔黏膜细胞。所述试剂盒可用于血脂异常的早期筛查或风险评估。有益效果与现有技术相比，本专利技术以检测ABCG1基因甲基化为基础的试剂盒可方便快捷的在分子水平上实现对血脂异常患病风险的检测；整个PCR过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，提高了检测的准确性；本专利技术试剂盒的设计简单方便，直接通过PCR得到的荧光信号判断基因位点的甲基化状态，使得结果的判断更加方便快捷。本专利技术试剂盒检测效率高，检测结果可靠、特异性和灵敏性高、针对性强，可辅助检测血脂代谢异常风险，进而提前预防。附图说明图1为实施例1中阳性样本的ABCG1基因甲基化检测情况。图2为实施例1中阴性样本的ABCG1基因甲基化检测情况。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1利用荧光定量平台检测冠心病易感基因多态性。1、募集研究对象：采用调查表的形式调查志愿者的一般情况，同时采集外周血5ml，放入EDTA抗凝管中，4℃储存。2、提取基因组DNA：使用天根生化科技有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒，产品编号DP318，按照操作说明提取血液基因组DNA，以0.8％琼脂糖凝胶电泳确定DNA质量和浓度。3、甲基化转化：对提取好的DNA进行重亚硫酸盐转化，未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶(C)不变。DNA重亚硫酸盐转化试剂盒来自天根生化科技(北京)有限公司，产品编号DP215。4、基因甲基化检测：采用荧光定量技术对甲基化位点进行检测，此技术的基本原理：在PCR反应体系中引入2种5'端采用不同荧光染料标记的寡核苷酸(探针)，两条探针分别识别ABCG1基因的甲基化位点与内参基因的非甲基化位点，探针的3'端连接淬灭基团。正常情况下，由于探针的5'端荧光基团和3'端淬灭基团紧邻在一起，荧光被淬灭。随着PCR反应的进行，与基因组样本能够互补的探针逐渐被DNA聚合酶5'→3'的外切酶活性切割，导致探针5'端上的荧光基团与3'端的淬灭基团分离，淬灭效应失效，从而荧光报告基团被激活，通过相应仪器检测荧光值可以被检测到；如与模板无法互补，则探针无法被聚合酶切割，因此检测不到相应的荧光信号，根据检测到的荧光信号波长，可以判断ABCG1基因与内参基因的甲基化程度。本次研究采用Primer3在线软件进行引物设计，然后进行引物合成，具体引物如表1所示。表1ABCG1及内参基因甲基化检测位点的PCR引物5、荧光PCR检测：将50ng处理后DNA分别加入到各自的50ulPCR体系中，其中每个反应体系包含100nmol每对特异引物，150nmol每对特异探针，1X探针法分型Mix(天根生化，中国，FP211)。同时设置阴性对照。荧光PCR检测仪为CFX96(biorad)，PCR反应程序为：95℃变性3分钟；95℃变性30秒，50℃复性延伸30秒，35个循环。最终循环后检测荧光信号。6、检测结果分析：利用上述反应体系对1例阳性样本和1例阴性样本进行检测，使用Bio-RadCFXManager(biorad)软件对采集数据进行分析，图1，图2即为分析结果，结果表明：目标基因Ct值与内参基因Ct值之差小于10，说明ABCG1基因甲基化程度高；目标基因Ct值与内参基因Ct值之差大于10，说明ABCG1基因甲基化程度低，判读方法如表2。表2结果判读参考7、试剂盒性能验证：利用配置完成的试剂盒进行产品精密度、稳定性的检测，根据上述设置的条件进行产品性能验证，使用上述样本，若目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均小于10，说明ABCG1甲基化程度高，血脂代谢异常风险高；若目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均大于10，说明ABCG1甲基化程度低，血脂代谢异常风险低。图1为阳性样本的ABCG1基因甲基化检测情况，4次重复，目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均小于10，说明ABCG1基因甲基化程度高；图2为阴性样本的ABCG1基因甲基化检测情况，4次重复，目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均大于10，说明ABCG1基因甲基化程度低。对比例1采用其它甲基化检测方法MSP(meth本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测血脂代谢相关基因ABCG1甲基化的试剂盒，其特征在于：包括ABCG1基因甲基化检测位点引物及探针序列，如SEQ ID NO.1‑3所示；内参基因检测位点引物及探针序列，如SEQ ID NO.4‑6所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测血脂代谢相关基因ABCG1甲基化的试剂盒，其特征在于：包括ABCG1基因甲基化检测位点引物及探针序列，如SEQIDNO.1-3所示；内参基因检测位点引物及探针序列，如SEQIDNO.4-6所示。2.根据权利要求1所述的一种用于检测血脂代谢相关基因ABCG1甲基化的试剂盒，其特征在于：所述ABCG1基因甲基化检测位点为ABCG1基因的2个CpG岛。3.根据权利要求1所述的一种用于检测血脂代谢相关基因ABCG1甲基化的试剂盒，其特征在于：所述内参基因为Actin。...
【专利技术属性】
技术研发人员：周梁良，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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