一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒，包括包被cTnI单克隆抗体的免疫磁珠、cTnI校准品溶液、铕标记的cTnI单克隆抗体溶液、清洗液和增强液。所述的包被cTnI免疫磁珠为带有官能团修饰的直径1~3μm的超顺磁珠分别与cTnI单克隆抗体共价偶联物。本发明专利技术的灵敏度高，cTnI的灵敏度为0.05ng/mL，血清(血浆)样本不需要稀释；检测时间短，30min出报告；样品需求量少，一次上样只需100μL；配套全自动时间分辨免疫分析仪，操作简单，节省人力。

【技术实现步骤摘要】
一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒
本专利技术涉及体外试剂检测
，具体地说，本专利技术涉及一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒。
技术介绍
肌钙蛋白是横纹肌收缩的调节蛋白，存在于心肌和骨骼肌中，由三种亚基组成，分别为TnI、TnC和TnT。三种亚基形成复合物，在肌肉收缩和舒张过程中起着重要调节作用。TnI为肌动蛋白的抑制亚基，有三种亚型：快骨骼肌亚型(fTnI)、慢骨骼肌亚型(sTnI)和心肌亚型(心肌肌钙蛋白I，cTnI)。其中心肌cTnI分子质量23.9kD，包含有210个氨基酸残基。cTnI含量升高可作为诊断急性心梗(acutemyocardialinfarction，AMI)的重要血清学指标。急性心梗近年来在世界范围内发病持续升高，而对AMI的治疗，再灌注治疗的效果与时间呈显著负相关，早期发现AMI对及时、正确治疗非常关键。目前常用诊断AMI的生化指标有肌红蛋白(myoglobin，MYO)、肌钙蛋白(troponinI，cTnI或troponinT，cTnT)和肌酸激酶同工酶(creatinekinasemass，CK-MB)。其中MYO半衰期短，峰值到达早，但是特异性差容易受到干扰，得到假阳性的检查结果；CK-MB特异性比较好，但是半衰期相对MYO长，需要更长的时间才能反馈病情，延迟医生的诊断和治疗。cTnI是目前诊断心肌梗死的金标准，目前检测cTnI的方法主要要胶体金法、荧光免疫层析法，但是这些方法普遍存在灵敏度低，准确度差等缺点；化学发光法虽灵敏度高，但检测时间长。对于AMI患者来讲，时间就是生命，为了实现对胸痛患者的早期识别并进行危险分层，我们需要更快提供准确结果的检测仪器和检测方法。为此，本专利技术将时间分辨荧光免疫分析技术与磁微粒相结合，提供了一种基于磁微粒的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法，能够检测样品中cTnI含量，检测结果更加准确可靠，具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。将大大提高AMI诊断率，在AMI早期诊断、疗效观察和预后判断中发挥越来越重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种成本低廉、操作简单、准确、灵敏的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒，包括包被cTnI单克隆抗体的免疫磁珠、cTnI校准品溶液、铕标记的cTnI单克隆抗体溶液、清洗液和增强液。在上述磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒中，所述的包被cTnI免疫磁珠为带有官能团修饰的直径1～3μm的超顺磁珠分别与cTnI单克隆抗体共价偶联物，其中所使用的磁珠为羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、NHS磁珠、链酶亲和素磁珠、蛋白A磁珠、蛋白G磁珠、抗小鼠IgG磁珠、亲水磁珠、疏水磁珠中的一种或几种。在上述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒中，所述免疫磁珠的制备方法为直径1～3μm的活化的磁微粒与所述对应单克隆抗体经洗涤、活化、偶联、封闭制备得到。制备方法为：吸取羧基磁珠到离心管中，将离心管放置在磁力架中，利用磁力架进行磁珠和缓冲液的分离，用0.1MpH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸洗涤磁珠3～5次；向上述洗涤好的磁珠中加入0.1MpH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸，加入20mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液和20mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺，室温震荡反应；将活化好的磁珠置于磁力架上，弃上清，收集活化好的磁珠；加入单克隆抗体，室温持续旋转孵育3～5小时，反应时间取决于磁珠的配位基与浓度；上述磁珠置于磁力架上，弃上清，收集免疫磁珠；加入含有5％BSA0.1MpH8.0的Tris-HCl缓冲液，重悬磁珠，封闭未偶联单克隆抗体的活化羧基位点，反应30～60分钟；上述磁珠置于磁力架上，弃上清，加入免疫磁珠保存液。所述的保存液为含5％(w/v)BSA，10％(w/v)海藻糖，0.1％(v/v)Tween-20的0.05MpH8.0的Tris-HCl缓冲液。所述铕标记的cTnI单克隆抗体溶液的制备方法为：按照cTnI抗体与Eu3+的质量比为5:1，将DTTA-Eu作为标记物，在0.05MpH8.0的碳酸盐缓冲液下，加入DTTA-Eu与cTnI单克隆抗体，混合后溶于0.05MpH8.0的碳酸盐缓冲液，室温震荡过夜；用葡聚糖凝胶柱纯化后收集峰管；将上述制备好的铕标抗体稀释，使cTnI抗体的终浓度为0.0060～0.0075g/L。所述清洗液的配方为：0.8～1.5％Tween-20，0.02％Proclin300，pH7.2～7.50.05MTris-Hcl缓冲液。所述增强液的配方为：0.03％乙酸钠、0.0002～0.0009％β-NTA、0.0024％TOPO、0.08％醋酸、0.1％无水乙醇、0.05％的TritonX-100的水溶液。所述cTnI校准品的制备方法为：用含1.5％Tween-20，0.02％Proclin300，pH7.50.02MTris-Hcl缓冲液将cTnI抗原稀释至0、0.05、0.1、0.5、1、5、25、50ng/ml。所述荧光物质的激发波长为300～350nm，发射波长为500～650nm。本专利技术所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒的检测原理为夹心法，试剂条的反应孔中预装有cTnI免疫磁珠，测试时，先将待测样本(血清或血浆)或者校准品加到试剂的反应孔中，再加入铕标cTnI抗体，振荡孵育20min，形成免疫磁珠-抗原-铕标抗体复合物。洗涤后，再加入增强液，在激发光的作用下，荧光物质发射一定波长的光信号，被免疫荧光检测仪识别，样本中被测物越多，产生的荧光信号强度越强。将cTnI校准品浓度与荧光信号值拟合剂量-反应曲线，即可按此测值得到未知样本中cTnI浓度。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)采用磁分离技术，形成的免疫复合物在外加磁场中直接沉淀，不需离心即可以将免疫复合物与未结合物质分离。因磁珠具有更大的结合面积与能在液相中分散而充分反应，大大提高检测范围，缩短反应时间，提高灵敏度。由于磁珠与抗原或抗体为共价偶联，克服了物理吸附的不稳定性，因此免疫磁珠保存时间久且更稳定。(2)采用时间分辨荧光免疫分析技术，采用镧系螯合物铕、铽、钐、镝作为标记物，其具有较宽的激发光谱、较窄发射光谱，有利于降低本底，提高灵敏度；紫外光激发具有较高量子产率、较大Stokes位移，避免激发光谱和荧光发射光谱以及生物基质发射的光谱重合，荧光衰变时间长等优点，比传统荧光物质检测范围更宽、特异性更好。(3)配套全自动检测仪器，实现自动化操作，可同时检测一份或多份样本中cTnI含量，样本用量少，操作简便快速(30分钟即可出结果)、为早期诊断AMI提供重要依据，为病人节约了宝贵的时间。附图说明图1是磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒利用试剂条进行检测，试剂条的结构俯视示意图。图2是磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒利用试剂条进行检测，试剂条的结构示意图。1、测试孔1，2、测试孔2，3、荧光标记物1，4、荧光标记物2，6、清洗液，7、清洗液，8、样本稀释液1，9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒，其特征在于包括包被cTnI单克隆抗体的免疫磁珠、cTnI校准品溶液、铕标记的cTnI单克隆抗体溶液、清洗液和增强液。

【技术特征摘要】
1.一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒，其特征在于包括包被cTnI单克隆抗体的免疫磁珠、cTnI校准品溶液、铕标记的cTnI单克隆抗体溶液、清洗液和增强液。2.如权利要求1所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒，其特征在于，所述的包被cTnI单克隆抗体的免疫磁珠为带有官能团修饰的直径1~3μm的超顺磁珠分别与cTnI单克隆抗体共价偶联物，其中所使用的磁珠为羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、NHS磁珠、链酶亲和素磁珠、蛋白A磁珠、蛋白G磁珠、抗小鼠IgG磁珠、亲水磁珠、疏水磁珠中的一种或几种。3.如权利要求1所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠的制备方法为：吸取羧基磁珠到离心管中，将离心管放置在磁力架中，利用磁力架进行磁珠和缓冲液的分离，用0.1MpH6.0的2-（N-吗啡啉）乙磺酸洗涤磁珠3~5次；向上述洗涤好的磁珠中加入0.1MpH6.0的2-（N-吗啡啉）乙磺酸，加入20mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液和20mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺，室温震荡反应；将活化好的磁珠置于磁力架上，弃上清，收集活化好的磁珠；加入单克隆抗体，室温持续旋转孵育3~5小时；上述磁珠置于磁力架上，弃上清，收集免疫磁珠。4.如权利要求3所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠还加入含有5%BSA0.1MpH8.0的Tris-HCl缓冲液，重悬磁珠，封闭未偶联单克隆抗体的活化羧基位点，反应30~60分钟。5.如权利要求4所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测cTnI试剂盒，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李根平，解巧丽，
申请(专利权)人：广州源起健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44