线粒体基因检测试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术提供一种线粒体基因检测试剂盒及其使用方法，该线粒体基因检测试剂盒包括两组引物对、用于PCR扩增的试剂，以及用于sanger测序的试剂。本发明专利技术提供的线粒体基因检测试剂盒具有检测成本低、操作方便、灵敏度高、特异性高等特点，能广泛应用于个体识别、亲缘关系鉴定等法医学领域。

Mitochondrial gene detection kit and its use

The present invention provides a mitochondrial gene detection kit and its use method. The mitochondrial gene detection kit includes two sets of primer pairs, reagents for PCR amplification, and reagents for Sanger sequencing. The mitochondrial gene detection kit provided by this invention has the characteristics of low detection cost, convenient operation, high sensitivity and high specificity, and can be widely used in the field of forensic medicine, such as individual identification, genetic relationship identification and so on.

【技术实现步骤摘要】
线粒体基因检测试剂盒及使用方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于sanger测序的线粒体基因检测试剂盒及使用方法。
技术介绍
人类线粒体DNA几乎存在于各种组织、细胞中,它是唯一分布于核外的人类遗传物质，具有自我复制、转录和编码的功能。线粒体DNA遵循母系遗传规律，即在排除突变的前提下,同一母系的个体线粒体DNA序列相同。因此现线粒体DNA检测越来越多的应用于法医领域，并展现出越来越重要的作用：（1）母系亲缘关系鉴定：是否来源于同一母系家族；（2）个体识别：在疑难、降解检材的同一性认定中发挥重要作用。人类线粒体DNA（mtDNA）呈双链环状，总长度为16569nt，分为编码区和控制区；控制区由1022bp(16024-16569bp及1-576bp)组成。其中的16024-16365，73-340以及438-574bp三个区域为多态高发区，分别称为高变1区(hypervariableregionⅠ，HVⅠ)、高变2区(hypervariableregionⅡ，HVⅡ)和高变3区(hypervariableregionⅢ,HVⅢ)。这三个区域的高度多态性在不同个体和不同母系家族中存在高度差异性，对法医学个体识别及亲缘鉴定具有重要的意义。为了将线粒体的上述特点应用到法医领域，现有多种线粒体基因测序方法，如申请号为201510863948.4的专利技术专利，提供了一种基于sanger测序人线粒体基因组的方法，此方法虽然避免了提取较高纯度mtDNA繁琐的实验操作过程，但是需要利用约二十组引物对在同一PCR反应条件下进行分段扩增，难以实现每一个片段都能被高品质地扩增出来，即难以实现扩增产物的单一性，所有者此专利中需要对每组扩增产物都进行琼脂糖凝胶电泳回收，如此，则大大增加了线粒体DNA扩增及回收的工作量。申请号为201410482243.3的专利技术专利，提供一种基于二代测序技术实现对线粒体的全长进行测序，达到法医学中个体识别等目的。但此方法基于二代测序技术，不仅检测成本高，且灵敏度还有待提高（此专利中需要的模板量至少为5ng；血斑作为检测样本时，其直径不小于1cm）。因此，迫切希望开发一种操作简单、检测成本低、灵敏度高的线粒体基因检测试剂盒，使其能更广泛地应用于亲缘鉴定、个体识别等法医领域。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种线粒体基因检测试剂盒，包括两组引物对、用于PCR扩增的试剂，以及用于sanger测序的试剂。所述的两组引物对为：第一组引物对：核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的下游引物；第二组引物对：核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的下游引物。用于PCR扩增的试剂具体包括：DNA聚合酶、dNTP和PCR反应缓冲液。作为优化，上述的线粒体基因检测试剂盒还包括用于DNA提取的试剂，对头发、指甲、牙齿、血斑、口腔脱落细胞等检材进行人总DNA提取。本专利技术的另一目的是提供上述线粒体基因检测试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：S1、PCR扩增，获得包括线粒体控制区信息的两组基因片段：以人总DNA为模板，以第一组引物对为引物，经过PCR扩增后获得第一组基因片段；以人总DNA为模板，以第二组引物对为引物，经过PCR扩增后获得第二组基因片段；S2、对S1中所述的两组基因片段分别进行sanger双向测序，得到两组测序数据结果；S3、比对结果：将S2中的两组测序数据结果分别与Anderson标准序列比对，获得基因特征点。由于每个人在线粒体控制区的基因特征点具有个体差异性，上述方法得到的基因特征点即可作为法医领域的个体识别。由于线粒体控制区的高度多态性在不同个体和不同母系家族中存在高度差异性，若将两个及以上不同人的基因特征点进行对比，则可用于进行所对比人群之间的母系亲缘关系鉴定。进一步地，步骤S2中，PCR扩增的反应参数为：预变性95℃，5min；变性95℃，45s；退火55℃，45s；延伸72℃，1min；终延伸72℃，5min；循环数35-45。为得到高品质的扩增产物，循环数优选为35个循环。本专利技术的第三个目的是提供一种线粒体基因检测试剂盒在法医个体识别产品中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种线粒体基因检测试剂盒在法医母系亲缘关系鉴定产品中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术的线粒体基因检测试剂盒采用一代sanger双向测序，检测成本低。2、本专利技术提供的线粒体基因检测试剂盒，对两组引物对进行创新设计，不仅能在同一PCR条件下扩增出两组特异的PCR产物，使得两组扩增产物包括线粒体控制区的所有信息，足以进行个体身份识别、亲缘关系鉴定等法医学领域的应用；而且将线粒体常见的两个异质性位点分别放在不同的PCR中进行扩增，避免在sanger双向测序时，两个异质性点因在同一扩增产物中而无法得到两个异质性点之间的碱基信息问题。3、灵敏度高。本专利技术提供的线粒体基因检测试剂盒，检测时所用的模板为人总DNA，避免了提取较高纯度mtDNA繁琐的实验操作过程；并且检测所用的DNA模板量可低至0.063ng，直径为2-3mm的血斑即可作为本专利技术的检测样本，十分有利于应用在提取基因组量少（如毛发、指甲等）的法医学领域。4、特异性高。本专利技术提供的线粒体基因检测试剂盒，针对人的总DNA，能特异地扩增出目的片段，对兔、猪等其他物种的DNA，均不能扩增出目标特异性产物，利于在经常有来源不明检材的法医学领域方面的推广应用。5、操作方便。本专利技术提供的线粒体基因检测试剂盒，只需要两组引物，在同一PCR条件下即可高品质地扩增出目的产物，扩增产物特异性高，无需采用琼脂糖凝胶电泳的方式进行扩增产物的进一步纯化，省时省力，操作便捷。附图说明图1为：在不同模板量条件下，以第一组引物对为引物，经过PCR扩增后的电泳结果图；图2为：在不同模板量条件下，以第二组引物对为引物，经过PCR扩增后的电泳结果图；图3为：以不同种属来源的DNA为模板，以第一组引物对为引物，经过PCR扩增后的电泳结果图；图4为：以不同种属来源的DNA为模板，以第二组引物对为引物，经过PCR扩增后的电泳结果图。具体实施方式本专利技术结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本专利技术范围。实施例1一种线粒体基因检测试剂盒，包括两组引物对、用于PCR扩增的试剂，以及用于sanger测序的试剂。所述的两组引物对为：用于PCR扩增的试剂具体包括：DNA聚合酶、dNTP和PCR反应缓冲液。作为优化，上述的线粒体基因检测试剂盒还包括用于DNA提取的试剂，对头发、指甲、牙齿、血斑、口腔脱落细胞等检材进行人总DNA提取。实施例2一种实施例1所述的线粒体基因检测试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：S1、PCR扩增，获得包括线粒体控制区信息的两组基因片段：（1）引物序列：（2）PCR组分：每对引物一个混合体系（3）PCR程序：预变性95℃，5min；变性95℃，45s；退火55℃，45s；延伸72℃，1min；终延伸72℃，5min；循环数35-45。S2、对S1中的两组基因片段分别进行sanger双向测序，得到两组测序数据结果；S3、比对结果：将S2中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种线粒体基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两组引物对、用于PCR扩增的试剂，以及用于sanger测序的试剂；所述的两组引物对为：第一组引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物；第二组引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物。

【技术特征摘要】
1.一种线粒体基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两组引物对、用于PCR扩增的试剂，以及用于sanger测序的试剂；所述的两组引物对为：第一组引物对：核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的下游引物；第二组引物对：核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的下游引物。2.根据权利要求1所述的线粒体基因检测试剂盒，其特征在于，所述的用于PCR扩增的试剂包括：DNA聚合酶、dNTP和PCR反应缓冲液。3.根据权利要求1所述的线粒体基因检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括用于DNA提取的试剂。4.一种权利要求1-2任一项所述的线粒体基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、PCR扩增，获得包括线粒体控制区信息的两组基...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁妍娇，刘洪伟，张桦林，万华靖，亓宇，廖勇，吴峰，
申请(专利权)人：成都新基因格生物科技有限公司，四川基因格司法鉴定所，
类型：发明
国别省市：四川,51