一种控制水稻小穗发育基因PIS1的应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，公开了一种控制水稻小穗发育基因PIS1的应用。具体涉及一个控制水稻小穗发育基因的定位、克隆、功能验证和应用。所述的PIS1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。PIS1决定水稻小穗的花器官发育，特别是雌蕊与雄蕊的发育。利用基因工程技术有目的地调控该基因在水稻中的表达，可以调节水稻的育性，创造水稻育种的新种质。因此，本发明专利技术对遗传改良水稻具有很好的应用前景。

Application of a gene PIS1 for controlling the growth of rice spikelet

The invention belongs to the field of plant genetic engineering technology, and discloses an application of a rice spikelet development gene PIS1. Specifically, it involves the location, cloning, functional verification and application of a gene controlling rice spikelet development. The nucleotide sequence of the PIS1 gene is shown in the sequence table SEQ ID NO.1, and the amino acid sequence encoded by the PIS1 gene is shown in the sequence table SEQ ID NO.2. PIS1 determines floral organ development of rice spikelets, especially pistil and stamen development. Using genetic engineering technology to regulate the gene expression in rice can regulate the fertility of rice and create new germplasm for rice breeding. Therefore, the invention has good application prospects for genetically modified rice.

【技术实现步骤摘要】
一种控制水稻小穗发育基因PIS1的应用
本专利技术属于植物基因工程领域。具体的说，涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻花器官发育的基因PIS1（PanicleInSpikelet），并利用转基因互补实验验证了该基因的功能。同时，还涉及利用该基因调控水稻性器官的发育，即通过利用遗传工程的方法调节PIS1基因的表达，从而控制水稻的育性，创造水稻育种的新种质。因此，本专利技术对遗传改良水稻具有很好的应用前景。
技术介绍
水稻是我国第一大栽培作物，在国民经济中占有举足轻重的地位。稻穗是水稻最重要的农艺性状之一，由若干小穗组成。水稻小穗既是繁殖器官，也是形成籽粒的基础，任何一个与之有关的重要基因发生功能性突变，均会导致其花器官发育异常而不能结实。因此，小穗一直是水稻遗传改良工作者关注的重点，深入理解小穗形成的分子机制，对指导水稻生产、特别是杂交水稻的品种选育，具有十分重要的意义。花是植物的最显著特征，花的形成是植物生活史上的一个重大转折点。植物花器官的形成是一个多基因参与调控的复杂生物学过程。20多年前，利用拟南芥等双子叶植物的突变体开展研究，花器官发育的分子遗传研究取得了很大进展，先后克隆了多个以MADS基因为主的花器官特征基因，提出了决定花器官形成的遗传模型。水稻小花的结构特异，与双子叶植物明显不同，但目前仍普遍认为，以MADS基因为主的花器官特征基因的功能相对保守，基于双子叶植物提出的花器官发育模型也基本适用于水稻等单子叶植物。尽管花器官特征基因的作用十分重要，但它们并不是植物花器官形成的唯一决定因素。近年来发现，作为花器官特征基因的上游调节基因（以转录因子为主），已被证实在不同时期、不同部位或不同调控路径中，通过激活或抑制花器官特征基因的表达，参与决定植物花器官的形成。近年来，植物中鉴定出一种数量少、但广泛分布于植物中的RBR（RB-related）基因。此类基因不仅参与调节细胞周期的进程、维持细胞增生与分化之间的平衡，也参与控制细胞的大小、细胞的死亡、维持干细胞分裂增殖及分化能力，从而在控制植物的根、茎、叶、花、种子等组织分化与器官形成中发挥至关重要作用。水稻中有2个RBR基因，但其具体功能并不清楚。本专利技术利用图位克隆的方法克隆了一个控制水稻小穗发育的因PIS1基因，该基因编码一个RBR蛋白（OsRBR1）。PIS1的功能缺失引起水稻小穗发育异常、性器官完全退化，而降低PIS1的表达则引起雄性不育。因此，利用基因工程技术有目的地调控该基因在水稻中的表达，可以调节水稻的育性，创造水稻育种新种质。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种控制水稻小穗发育的基因，该基因失活造成水稻花器官发育异常，而降低该基因的表达量则导致雄性不育。本专利技术还提供一种该基因的转基因植株在改良水稻育性中的应用。为实现以上目的，采用以下技术方案：PIS1基因具有如SEQIDNo.1所示的DNA序列，也包括与SEQIDNo.1所示的DNA序列至少有90%同源性的基因序列。本专利技术中的SEQIDNo.2所编码的蛋白质是一种植物的RBR蛋白，其中包括进行一个或几个氨基酸替换、插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQIDNo.1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本专利技术的目的。本专利技术克隆的水稻PIS1基因的单碱基突变体表现为小穗发育明显异常，但其它性状完全正常（见实施例1）。将正常功能的PIS1基因转化该突变体后，植株恢复正常表型（见实施例2）。本专利技术还提供一种用PIS1基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本专利技术提供了SEQIDNo.1所示的序列基因或该基因类似的部分功能片段的载体，如图4所示（见实施例2）。该载体还有一种含有以上表达载体的宿主细胞。该宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌和植物细胞。本专利技术利用反义RNA技术抑制水稻内源PIS1基因的表达，造成水稻雄性不育但其它性状完全正常，可用于培育水稻不育系材料（见实施例3）。具体地说，就是将PIS1基因与其它调控元件如组成型启动子或器官特异性启动子融合构建基因抑制表达载体，通过转基因技术（如反义RNA或RNAi）人为控制水稻的育性，创造新的水稻雄性不育种质，可用于选育水稻新品种。实现本专利技术的具体技术步骤如下：一．水稻pis1突变体的分离和遗传分析：利用辐射诱变水稻品种明恢86，本专利技术获得了一种如图1所示的小穗发育明显异常但其它性状完全正常的突变体pis1。除外稃发育正常外，该突变体小穗的其它花器官均明显异常，其花分生组织的决定性丧失，在大部分小穗的中央长出一个穗状的结构。通过突变杂合体植株自交及与野生型植株正反交实验，证明pis1是一个符合单基因控制的遗传规律。二、图位克隆PIS1基因：1．PIS1的定位：为了分离PIS1基因，本专利技术采用图位克隆的方法，首先创建了一个F2定位群体，由PIS1突变杂合体为母本、DZ60为父本杂交获得的F2中的psd1突变体组成。利用水稻微卫星标记和InDel标记对PIS1基因进行定位，将PIS1基因精细定位于如图2所示的BAC克隆AP004592上的InDel4和InDel5之间约32kb的范围内，通过分析此区段中突变体与野生型的基因组序列差异，以确定候选基因。定位结果如图2所示。2．PIS1基因的鉴定和功能分析：构建了一个如图3所示的互补实验载体。本专利技术通过转基因技术将互补载体转入pis1突变体后获得了如图4所示的表型恢复正常的转基因水稻，证明了本专利技术正确克隆了PIS1基因；氨基酸序列分析表明，PIS1编码一个RBR蛋白。三、抑制水稻内源PIS1的表达，创制水稻新型雄性不育系材料利用反义RNA技术抑制水稻内源PIS1基因的表达，造成水稻小穗的雄性不育而不能结实，可用于培育水稻新型不育系材料（见实施例3）。本专利技术的优点在于：目前主要是利用杂交水稻的杂种优势来培育高产水稻品种。本专利技术获得的水稻小穗发育明显异常但其它性状完全正常的突变体pis1，是单基因隐性突变，符合孟得尔遗传规律。本专利技术通过图位克隆技术获得了PIS1基因，并通过功能互补实验鉴定了该基因的功能。氨基酸序列分析表明，该基因编码一个RBR蛋白。而减少水稻内源PIS1基因的表达，造成水稻小穗的雄性完全不育。因此，可以利用基因工程技术有目的地调节它在水稻中的表达，进而可培育出水稻不育系新种质，以提高水稻的产量、提高杂交制种质量、降低生产成本。因此，该基因具有非常重要的应用价值和广阔的应用前景。附图说明图1：水稻野生型与对应突变体pis1的表型；A：野生型与对应突变体pis1的小穗表型；B：野生型小穗的表型（张开内、外稃片）；C：pis1突变体小穗的表型。图2：PIS1基因精细定位及候选基因确定图。图3：互补实验载体的图谱。图4：野生型、pis1突变体与互补实验T0代的小穗表型图。图5：RNAi实验载体pTCK303-OsRBR1的图谱。图6：野生型与RNAi-T0代小穗的育性表型图；A：野生型的雄性可育与RNAi-T0代的雄性不育的表型图（去除内、外稃片）；B：野生型的高结实率与RNAi-T0代无结实的表型图。具体实施方式实施例1：水稻PIS1基因的图位克隆1．水稻材料和定位群体：如图1所示的水稻突变体pis1为本专利技术者利用辐射诱变的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.PIS1基因在控制水稻花器官发育中的应用。

【技术特征摘要】
1.PIS1基因在控制水稻花器官发育中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PIS1基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：段远霖，吴为人，陈亚光，赵粉，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35