与新铁炮百合光周期成花途径相关的基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了2个与新铁炮百合光周期成花途径相关的基因及其应用。所述基因分别为LfCOL5和LfCOL6，来自于新铁炮百合，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示，或为在SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且同样与新铁炮百合光周期成花途径相关的核苷酸序列。本发明专利技术首次提供了2个在新铁炮百合光周期成花途径中起关键作用的LfCOL基因，且分析揭示了这些基因的功能，探索新铁炮百合成花调控的分子机制，为百合花期的改良提供了基础。

Genes related to photoperiod flowering in Lilium Lilum and their application

The invention belongs to the field of biotechnology, and specifically discloses 2 genes related to the photoperiod flowering pathway of lily, and their applications. The genes are LfCOL5 and LfCOL6, respectively, from the new iron gun lilies. The nucleotide sequences, such as SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.3, are replaced, missing or added one or several nucleotides in the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO.1 or SEQ, and are also related to the flower pathway of the new iron gun Lily photoperiod. Nucleotide sequence. For the first time, the invention provides 2 LfCOL genes that play a key role in the photoperiod formation of the new Lilium. The analysis reveals the functions of these genes and explores the molecular mechanism of the regulation of the flower formation of new Lilium Lilium, which provides a basis for the improvement of Lilium florescence.

【技术实现步骤摘要】
与新铁炮百合光周期成花途径相关的基因及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及2个与新铁炮百合光周期成花途径相关的基因及其应用。
技术介绍
植物的成花过程是植物整个生命周期中最重要的阶段，对于后续的生殖成功和结实具有至关重要的作用。在植物复杂的成花调控中，光周期是植物感受外界条件诱导成花的关键信号。在模式植物拟南芥中的研究表明，感受光周期的核心机制存在于CO基因对昼夜节律的感受和表达以及随后由光周期诱导的FT基因的表达转变，CO基因是植物内部的节律钟和外部光周期变化的整合关键点，在植物光周期途径中起着至关重要的作用。只有长日照条件下，CO基因在傍晚时分出现的表达高峰能维持CO蛋白质的稳定，并进一步促进FT基因的表达，从而诱导开花。CO基因最早从拟南芥开花延迟突变体中获得，之后从拟南芥中又分离得到16个COL基因，共同构成了COL基因家族。COL基因编码的COL蛋白包含两个靠近氨基端的锌指蛋白B-box结构域和一个靠近羧基端的CCT结构域，这两个结构域对CO基因的功能非常重要。在拟南芥中，根据B-box结构域的保守性可以将其分为三类：第一类(CO和COL1-5)含有两个B-box结构域；第二类(COL6-8和COL16)含有一个B-box结构域；第三类(COL9-15)含有一个正常的B-box结构域和一个二级结构发生改变的B-box结构域。通过对拟南芥COL基因家族成员的研究发现，不是每个成员都能调控成花转变，并且一些成员还参与到其他生理发育过程。在其他植物包括双子叶植物和单子叶植物中，都克隆到了CO同源基因或基因家族，如双子叶植物大豆、甘菊、甜菜和杨树等，单子叶植物水稻、小麦、大麦和黑麦草等。对CO基因的序列信息、表达模式和功能分析等进行研究，发现CO-FT模式在成花诱导中的作用是高度保守的，但是不同成员间的功能存在较大的差异，这表明CO基因家族在进化过程中功能发生了变化，不同种之间差异较大。百合是球根花卉产业中重要的种类之一。多数百合用种子繁殖需要两到三年才能开花，而新铁炮百合用种子繁殖无需低温春化可以在一年内开花，这一珍贵的开花特性对于百合的花期改良育种和降低生产成本十分重要。新铁炮百合是长日照植物，长日照条件对新铁炮百合的成花转变非常重要，因此光周期途径是新铁炮百合成花的关键途径。并且在长日照条件下，新铁炮百合成花转变过程包含了4个关键时期，包括幼龄期(播种后至7-8片叶)、诱导期(抽葶前后)、成年期(5-6节间)及分化期(9-10节间)。因此，开发在新铁炮百合光周期成花途径中起关键作用的基因，对百合花期改良及培养生育期短百合新品种具有重要的实际应用价值。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供2个在新铁炮百合光周期成花途径中起关键作用的LfCOL基因，分析揭示这些基因的功能，探索新铁炮百合成花调控的分子机制，为百合花期改良提供基础。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术首先提供了2个与新铁炮百合光周期成花途径相关的基因，所述基因分别为LfCOL5和LfCOL6。所述基因来自于新铁炮百合，所述LfCOL5和LfCOL6的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.3所示，或为在SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且同样与新铁炮百合光周期成花途径相关的核苷酸序列。本专利技术对上述2个LfCOL基因及LfFT1基因(GeneBankNo.KJ744207)在长日照和短日照条件下的时期表达及昼夜表达模式进行了分析。结果显示，LfCOL5、LfCOL6和LfFT1在长日照条件下新铁炮百合成花诱导期高表达，并且连续三天呈现有规律的昼夜振荡表达模式，其表达模式与拟南芥CO基因一致，说明LfCOL5、LfCOL6可能是长日照诱导新铁炮百合成花转变中发挥积极作用的开花促进因子。基于本专利技术的上述发现，本专利技术首次提出了2个新的与新铁炮百合光周期成花途径相关的基因，并验证了基因的功能。因此，由本专利技术所述基因转录得到的RNA，以及由本专利技术所述基因编码表达的蛋白质也应当属于本专利技术的保护范围。所述蛋白质可根据所述基因具体的核苷酸序列，可根据本领域公知常识推知。当所述基因如SEQIDNO.1和SEQIDNO.3所示时，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4所示。进一步地，本专利技术还提供了用于扩增所述基因的引物，详见表3。进一步地，含有本专利技术所述基因的载体也属于本专利技术的保护范围。所述载体可采用本领域常规技术手段制备得到，优选为植物表达载体。作为一种示例性说明，本专利技术提供一种所述载体的构建方法，包括如下步骤：(1)提取新铁炮百合叶片基因组RNA，反转录得cDNA，以所述cDNA为模板，利用前述扩增本专利技术所述基因的引物，经PCR扩增获得目的基因(LfCOL5或LfCOL6)；(2)将步骤(1)所得到的PCR产物，克隆至pLB载体，选取测序正确的菌株提取其质粒；(3)以步骤(2)的质粒为模板，利用带有NcoⅠ酶切位点的上游引物和带有BstEⅡ酶切位点的下游引物进行PCR扩增，得到带有粘性末端的扩增片段；(4)用BstEⅡ-HF和NcoI-HF对pCAMBIA1301进行双酶切，并回收酶切产物；(5)采用In-Fusion酶将步骤(3)所得的带有粘性末端的扩增片段与步骤(4)所得的酶切产物进行连接；(6)将步骤(5)所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行抗性筛选，并挑去阳性菌斑进行测序验证，测序正确的菌株提取其质粒，即为含有目的基因为LfCOL5或LfCOL6基因的载体。其中，BstEⅡ-HF、NcoI-HF和In-Fusion酶为本领域常用的酶切酶。更进一步地，含有本专利技术所述基因的工程菌或转基因细胞系也属于本专利技术的保护范围。其中，所述转基因细胞系不包括具有分生能力的细胞系。第二方面，本专利技术提供了所述基因在新铁炮百合成花诱导方面的应用。本专利技术为了进一步验证2个基因的功能，分别构建了含有LfCOL5、LfCOL6基因的植物表达载体，利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥co晚花突变体。结果表明，获得的转基因拟南芥平均抽葶时间及开花时间都比拟南芥co晚花突变体早12-13天，比野生型植株早6-7天，平均莲座叶数目比拟南芥co晚花突变体少12-14片，比野生型植株少5-6片。因此可以确定，LfCOL5、LfCOL6基因是长日照诱导新铁炮百合成花转变的重要促进因子。尤其是LfCOL6基因，是新铁炮百合中特有的能促进成花诱导的基因。该实验结果体现了新铁炮百合LfCOL基因家族在系统发育、进化及基因功能方面具有特异性。本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次提供了2个在新铁炮百合光周期成花途径中起关键作用的LfCOL基因，且分析揭示了这些基因的功能，探索新铁炮百合成花调控的分子机制，为百合花期的改良提供了基础。附图说明图1为实施例2中长日照条件下新铁炮百合LfCOLs基因家族成员及LfFT1基因时期表达模式。L1-L9时期为长日照条件下新铁炮百合不同发育时期，分别为L1：1-2片基生叶，L2：2-3片基生叶，L3：5-6片基生叶，L4：9-10片基生叶，L5：1-2节间(刚抽葶)，L6：5-6节间，L7：7-8节间本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与新铁炮百合光周期成花途径相关的基因，其特征在于，所述基因为LfCOL5或LfCOL6，来自于新铁炮百合，所述LfCOL5和LfCOL6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示，或为在SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且同样与新铁炮百合光周期成花途径相关的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.与新铁炮百合光周期成花途径相关的基因，其特征在于，所述基因为LfCOL5或LfCOL6，来自于新铁炮百合，所述LfCOL5和LfCOL6的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.3所示，或为在SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且同样与新铁炮百合光周期成花途径相关的核苷酸序列。2.由权利要求1所述基因转录得到的RNA。3.由权利要求1所述基因编码表达的蛋白质。4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4所示。5.用于扩增权利要求1所述基因的引物。6.含有权利要求1所述基因的载体。7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体的构建方法包括如下步骤：(1)提取新铁炮百合叶片基因组RNA，反转录得cDNA，以所述cDNA为模板，利...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾桂霞，赵玉倩，闫笑，汪莲娟，张倩，曹钦政，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11