一种重组黄花蒿1类变应原蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种哺乳动物细胞表达的黄花蒿主要致敏蛋白Art a1，编码基因、表达方式、纯化工艺，以及重组蛋白检测方法和应用。黄花蒿致敏蛋白本身属于植物蛋白，在现有常用的原核或真核表达系统中表达都有一定困难，也并见相关文献公开；而传统的提取方式常存在着成分复杂、质量难以控制、易受到外源性有毒物质、病原体微生物的污染等问题。为此，本发明专利技术提供了如SEQ ID NO：1所示的重组Art a1的编码基因，以及专为此设计的表达、纯化、重组蛋白检测方法及应用，与现有技术相比，本发明专利技术的重组Art a1具有较高的表达量及活性，同时也为该药品开发过程中细胞株开发、工艺优化、临床前和临床研究以及工业化生产建立了基础。

A recombinant allergenic protein of Artemisia annua 1 and its application

The present invention relates to a main sensitizing protein Art A1 of Artemisia Artemisia expressed in mammalian cells, encoding gene, expression mode, purification process, and the method and application of recombinant protein detection. Artemisia Artemisia is a plant protein. It is difficult to express in the existing prokaryotic or eukaryotic expression system, and the related literature is open. However, the traditional extraction methods often have the problems of complex components, difficult quality control, easy to be contaminated by exogenous toxic substances, pathogens and so on. To this end, the present invention provides the encoding gene of the recombinant Art A1, as shown by SEQ ID NO:1, and the expression, purification, recombinant protein detection method and application specially designed for this purpose. Compared with the existing technology, the recombinant Art A1 of the present invention has high expression and activity, and also is the development of cell strain in the development process of the drug. It has established the foundation for process optimization, pre clinical and clinical research and industrial production.

【技术实现步骤摘要】
一种重组黄花蒿1类变应原蛋白及其应用
本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种重组黄花蒿1类变应原蛋白及其编码基因和表达纯化方法。
技术介绍
近年来过敏性花粉症的发病率呈逐年上升，欧洲的发病率由20世纪初的1％上升到了20％，并预计在未来20年内可达到35％。我国花粉症患者已逾1000万人，城市居民发病率为0.9％左右，流行区可达5％，随着城区树木花草品种越来越多，花粉过敏症患者有增加的趋势。花粉是高等植物的雄性生殖细胞，在风或虫的作用下，在空气中传播，有些人在呼吸过程中吸人花粉后，便会产生过敏反应。花粉的飘散具有明显的季节性。春天的风媒花粉多来源于树木；晚春和初夏的风媒花粉多来源于牧草；夏末和秋初的风媒花粉多来源于杂草。目前已知可以引起人类过敏的花粉主要有蒿属花粉(Artemisia)、豚草属花粉(Ambrosia)、蓖麻属花粉(Ricinus)、葎草属花粉(Hummlus)、藜属花粉(Chenlpldum)、苋属花粉(Amaranthus)、木麻黄属花粉(Casuarina)、桦木属花粉(Betula)、松属花粉(Pinus)、云杉属花粉(Picea)、柳杉属花粉(Cryptomeria)、悬铃木属花粉(Platanus)等。这些植物的花粉因其病原性强，致敏率高，数量大，散播范围广；且植物自身分布的范围广，数量亦丰富，对花粉污染的影响大，因而这些植物成为较重要的花粉污染源植物。由于花粉污染源植物的分布受气候、土壤、生物和地形等因素的影响，因而不同地区，其主要的花粉污染源植物亦不相同。在我国，因多数地区(如北京、新疆、山西、山东、武汉、沈阳、广州、宁夏等地)的主要花粉均为蒿属植物花粉，因此我国的花粉污染源植物以蒿属植物最为严重。目前，临床上主要采用黄花蒿粗提液治疗蒿属花粉过敏引起的过敏性鼻炎与过敏性哮喘等过敏性疾病的脱敏治疗，例如浙江我武生物2016年6月份批准的黄花蒿粉滴剂即为黄花蒿提取液。由于天然变应原提取液的组成非常复杂，界定其组分非常困难，含大量杂质、色素以及非活性成分，诊断特异性及疗效不理想，且容易受到外源性有毒物质、病原体微生物的污染。而另一方面，黄花蒿变应原蛋白本身属于植物蛋白，在现有常用的原核或真核表达系统中表达都有一定困难，也并见相关文献公开。
技术实现思路
为了克服以上缺点，专利技术人将重组黄花蒿1类变应原(以下简称rArta1)基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中进行了优化，并在分子设计时加入了提高rArta1表达的作用原件，专利技术人惊喜地发现，经过基因优化后rArta1与现有技术相比具有更高的表达量，且与天然蛋白相比具有相似的生物学活性。本专利技术的一个目的是提供一种编码rArta1蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。该序列针对哺乳动物细胞CHO表达系统进行了密码子优化，其更利于rArta1在哺乳动物细胞CHO中表达。本专利技术的另一个目的是提供一种rArta1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术的另一个目的是提供一种含有上述编码优化后rArta1基因的载体，优选的，所述的载体为pcDNA3.1，pcDNA3.3-TOPO，pOptiVECTM-TOPO，pCHO1.0。本专利技术的另一个目的是提供一种包含上述所述载体的哺乳动物细胞CHO细胞株，优选的，所述哺乳动物细胞CHO细胞株为CHO-K1，CHO-DHFR，DG44，CHO-S。上述所述载体优选为pCHO1.0或pOptiVECTM-TOPO，更优选为pCHO1.0。上述所述哺乳动物细胞CHO细胞株优选为DG44或CHO-S细胞株，更优选为CHO-S细胞株。本专利技术的另一个目的是提供一种rArta1蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：A.构建含有上述编码rArta1基因的载体；B.将步骤A的载体线性化后转入哺乳动物细胞CHO细胞株中，并在合适的条件下培养；C.回收纯化蛋白质。本专利技术的另一个目的是提供一种rArta1蛋白纯化方法，所述纯化方法如下：A.将rArta1分批补料培养液低温高速离心收集上清，20mM磷酸盐缓冲液超滤，0.45μm滤膜过滤。B.阳离子交换层析，用平衡缓冲液平衡层析柱，接着运用全自动智能蛋白纯化系统(AKTAavant150，购自GEhealthcare公司)中Q阀对平衡缓冲液和洗脱缓冲液进行自动配置，将步骤A中预处理的分批补料培养液通过分离填料，然后运用洗脱缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰，平衡缓冲液和洗脱缓冲液pH＝5.5。本专利技术的另一个目的是提供一种rArta1蛋白在制备治疗黄花蒿花粉过敏症药物中的应用，所述rArta1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术在哺乳动物细胞中表达的rArta1不仅具有较高的产量，而且与nArta1相比具有非常相似的生物学活性。并且，制备和纯化工艺简单，经一步纯化即可获得重组变应原。与粗提液相比具有以下优势：(1)重组变应原具有更高的纯度，与粗提液相比不含非变应原成分、酶类、酶抑制剂和毒性蛋白等；(2)重组蛋白具有较好的特异性，粗提液中成分复杂，患者可能只与其中部分成分反应，特异性差，而重组变应原成分单一，特异性好；(3)重组变应原活性可替代天然提取液，与天然提取液相比减少IgE结合的抗原表位，有效降低IgE介导的过敏反应，同时保留变应原T细胞识别所必须的结构域，具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，提高脱敏治疗的效果。附图说明图1表示优化前后重组rArta1基因序列对比图。其中优化前序列对应的为天然rArta1基因核苷酸序列；优化后序列对应的为本专利技术的重组rArta1的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。图2-a，图2-b为优化前后rArta1基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中的CAI指数。其中，图2-a表示天然rArta1基因核苷酸序列在哺乳动物细胞CHO表达系统中CAI指数经程序计算为0.75；图2-b表示优化后的本专利技术的rArta1密码子在哺乳动物细胞CHO表达系统中CAI指数经程序计算为0.95。图3-a，3-b为密码子优化前后rArta1基因在哺乳动物细胞CHO表达宿主中最优密码子频率分布区域图。其中图3-a表示rArta1天然基因核苷酸序列在哺乳动物细胞CHO系统中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：rArta1天然基因核苷酸序列的低利用率密码子出现百分比为9％；图3-b表示优化后的本专利技术的rArta1密码子在哺乳动物细胞CHO系统中最优密码子频率分布区域图，优化后的本专利技术的rArta1密码子序列低利用率密码子出现为0。图4-a，4-b为密码子优化前后rArta1基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中平均GC碱基含量分布区域图。其中，图4-a表示rArta1天然基因核苷酸序列在哺乳动物细胞CHO表达系统中平均GC碱基含量为：52.64％；图4-b表示优化后的本专利技术的rArta1密码子在哺乳动物细胞CHO表达系统中平均GC碱基含量为：58.97％。图5为rArta1基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为500bpDNALadder；泳道2为两端含有AvrII和BstZ17I酶切位点的rArta1基因PCR产物。图6为rArta1表达质粒pCHO1.0-rArta1构建过程图。图7-a，7-b为rArta1基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组黄花蒿1类变应原蛋白的编码基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
2016.12.31 CN 20161127052521.一种重组黄花蒿1类变应原蛋白的编码基因，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。2.一种含有如权利要求1所述的编码基因的载体，所述的载体为pcDNA3.1、pcDNA3.3-TOPO、pOptiVECTM-TOPO或pCHO1.0。3.一种含有如权利要求2所述的编码基因的载体，所述的载体为pCHO1.0。4.一种包含有如权利要求3所述的载体的CHO细胞株，所述细胞株为CHO-S细胞株。5.一种重组黄花蒿1类变应原蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：A.构建含有如权利要求3所述的载体；B.将步骤A的载体线性化后转入如权利要求4所述的CHO宿主细胞中，并在合适的条件下扩大培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，王安良，王俊，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，常州京森生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32