梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53及其在提高植物抗旱能力方面的应用制造技术

本发明专利技术提供了梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53及其在提高植物抗旱能力方面的应用，属于植物基因工程技术领域；所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，过表达所述的梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。根据实施例部分的记载，烟草和秋子梨的转基因超表达株系与对照野生型相比抗旱能力有了很大提升。

Drought induced transcription factor PbrWRKY53 in Pear and its application in improving drought resistance of plants

The invention provides the pear drought induced transcription factor PbrWRKY53 and its application in improving plant drought resistance, belonging to the field of plant genetic engineering technology; the nucleotide sequence of the pear drought induced transcription factor PbrWRKY53, as shown by SEQ ID No.1, is shown by the amino acid sequence of the encoded protein, as shown by the SEQ ID No.2, over a table. The drought inducible transcription factor PbrWRKY53 of pear can effectively enhance the scavenging capacity of reactive oxygen species of transgenic plants, thus enhancing the drought resistance of plants. According to the part of the practice, the transgenic overexpression lines of Nicotiana pygmae and Pyrus were increased greatly compared with the wild type.

【技术实现步骤摘要】
梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53及其在提高植物抗旱能力方面的应用
本专利技术属于植物基因工程
，尤其涉及梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53及其在提高植物抗旱能力方面的应用。
技术介绍
梨是当今世界上主要栽培的经济果树树种之一。中国是梨重要的起源地之一，是全世界梨产量位居第一的大国。我国梨优势产区的布局与规划极大地促进了梨产业的快速发展，因为梨产区在我国分布广泛，所以梨树的生长和发育很容易受到地理和气候条件等因素的影响，如干旱，冻害，盐碱等。因此，培育抗逆性强和综合性状良好的的抗逆新品种就成为了梨产业在我国发展至关重要的因素。然而由于梨在育种方面存在遗传杂合度高，世代周期长、大多数自交不亲和、育种目标不可确定性等问题，导致梨育种进展缓慢，常规的育种方法已经不能满足现代梨产业栽培对品种的需求。根据统计，世界每年农作物50％的产量损失与非生物胁迫相关，20％的产量损失与病虫害等生物胁迫有关。例如，当植物受到干旱胁迫后会导致植物体内出现多种不良反应，如细胞内活性氧的积累以及渗透压的变化等。干旱胁迫通常能触发植物基因表达增强或减弱、代谢产物增加或减少、特异蛋白合成等应答活动。在干旱胁迫的情况下，植物为抵御干旱胁迫，其细胞内可以大量合成甜菜碱、脯氨酸、海藻糖、甘露醇等渗透性的有机小分子物质，以期增加细胞的渗透势，缩小与周围环境的渗透势差，从而使植物避免因高渗透势差导致细胞过度失水死亡。植物能通过积累多胺类化合物，如腐胺、亚精胺、精胺，来应答干旱胁迫。植物主要通过积累多胺类化合物、细胞内活性氧的清除、细胞内渗透压的调节来提高植物的抗旱性。因此，研究干旱胁迫下相关基因的调控途径及作用机理对于培育抗干旱新品种来说具有十分重要的意义。目前，尚没有梨抗干旱相关基因研究报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53及其在提高植物抗旱能力方面的应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53，所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还提供了所述的梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术提供了所述的梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53或所述的蛋白质在提高植物抗旱能力方面的应用。优选的，所述植物包括烟草或梨。优选的，所述植物为烟草时，包括以下步骤：1)提供所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53；2)将所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53与载体连接获得重组载体；3)将所述重组载体转入根癌农杆菌中获得重组根癌农杆菌；4)将所述重组根癌农杆菌侵染烟草，获得过表达梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53的烟草。优选的，步骤1)为：以梨叶片cDNA为模板，进行PCR扩增得到梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53；所述扩增用引物对包括正向引物F1和反向引物R1；所述正向引物F1的序列如SEQIDNo.3所示；所述反向引物R1的序列如SEQIDNo.4所示。优选的，所述梨为秋子梨。优选的，所述植物为秋子梨时，所述应用采用瞬时转化方法将所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53转入秋子梨中。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53，经生物学功能验证具有提高植物抗旱能力的作用，过表达所述的梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。本专利技术提供的梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53为植物抗非生物逆境分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好；所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53能够应用于抗旱植物品种的培育，根据实施例部分的记载，烟草和秋子梨的转基因超表达株系与对照野生型相比抗旱能力有了很大提升，烟草的转基因超表达株系中过氧化氢(H2O2)及丙二醛(MDA)的含量均要比野生型要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小。附图说明图1为本专利技术梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53的克隆、分离和功能验证的流程示意图；图2为实施例2中梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53在脱水、低温4℃和脱落酸胁迫下的表达示意图；图3为实施例3中本专利技术梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53亚细胞定位图；图4为实施例4中表达重组载体的构建流程和载体结构图，其中图4A为重组表达载体的构建流程，图4B为pMV载体结构图；图5为实施例4中PbrWRKY53转化烟草及植株再生过程示意图；图6为实施例4中转PbrWRKY53基因株系及野生型(WT)干旱处理前后的表型和生理指标测定图；图7为实施例5中PbrWRKY53基因瞬时转化秋子梨株系(OE1和OE2)及野生型植株(WT)室温下干旱处理14天后的表型和生理指标测定图；图8为实施例4中烟草植株和实施例5秋子梨植株，在室温下干旱处理后未转化株系和转化株系组织中过氧化氢含量，抗超氧阴离子自由基含量和丙二醛含量的测定结果图。具体实施方式本专利技术提供了梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53，所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。在本专利技术中，所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53优选的来源于杜梨(Pyrusbretschneideri)，所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53包含1044bp的开放阅读框。在本专利技术中所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53通过以下方法获得：从杜梨叶片中提取获得杜梨的RNA；将所述RNA反转录获得cDNA；以所述cDNA为模板，用正向引物F1和反向引物R1扩增获得所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53。在本专利技术中，所述正向引物F1的序列如SEQIDNo.3所示，具体为5’-ggtgagcttaggagagggccatggactc-3’；所述反向引物R1的序列如SEQIDNo.4所示，具体为5’-cgctgctcgtgtcgattcggagatgccgg-3’。在本专利技术中，所述杜梨叶片优选的采用长势健壮的杜梨幼苗的叶片，所述杜梨的RNA的提取采用本领域常规的植物组织RNA提取方法即可，无其他特殊限定，在本专利技术具体实施过程中采用CTAB法，所述CTAB法提取RNA的步骤和方法采用本领域常规步骤和方法即可。本专利技术在获得杜梨RNA后，反转录获得cDNA；在本专利技术中所述反转录采用本领域常规的方法即可，优选的采用TOYOBO反转录试剂盒进行，具体方法步骤参照所述试剂盒的说明书。本专利技术在获得所述cNDA后，以获得的cDNA为模板，用正向引物F1和反向引物R1扩增获得所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53。在本专利技术中所述所述正向引物F1的序列如SEQIDNo.3所示；所述反向引物R1的序列如SEQIDNo.4所示。在本专利技术具体实施过程中，所述扩增体系优选的为50μl体系，所述扩增体系包括100ng模板DNA，5×Q5反应缓冲液(Q5ReactionBuffer)，10mMdNTPs，1UQ5高保真聚合酶(Q5High-FidelityDNAPolymerase)，1.0μM正向引物和1.0μM的反向引物。本专利技术中所述的5×本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53，其特征在于，所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53，其特征在于，所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.权利要求1所述的梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。3.权利要求1所述的梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53或权利要求2所述的蛋白质在提高植物抗旱能力方面的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物包括烟草或梨。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草时，包括以下步骤：1)提供权利要求1所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53；2)将所述梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53与载体连接获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄小三，刘月，顾冰洁，林泽崑，邢才华，张绍铃，李凌，胡轼，赵梁怡，董慧珍，高俊芝，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32