一种细胞因子组合物在体外培养造血干细胞中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种细胞因子组合物在体外培养造血干细胞中的应用，属于生物工程和生物医药技术领域，所述细胞因子组合物主要包括单核细胞趋化因子1、干细胞因子、白细胞介素‑1β、血小板衍生因子、分化抑制因子和白细胞介素6，并利用细胞因子组合物制备代血清培养基，所述培养基的制备方法包括：(1)制备培养底物层，(2)制备磁性抗原，(3)制备无菌培养基液；培养基体外培养造血干细胞的扩增方法包括：(1)造血干细胞的富集，(2)造血干细胞的体外扩增与收获，(3)造血干细胞的磁分离。总之，本发明专利技术能有有效提高造血干细胞的体外增殖率，在药物研究和临床治疗中具有积极意义。

Application of a cytokine combination in vitro culture of hematopoietic stem cells

The present invention discloses the application of a cytokine composition in the culture of hematopoietic stem cells in vitro, which belongs to the field of bioengineering and biological medicine. The cytokine composition mainly includes monocyte chemoattractant factor 1, stem cell factor, interleukin 1 beta, blood small plate derivative factor, differentiation inhibitor and white fine. Cytokine 6, and using cytokine composition to prepare the medium for generation of serum, the preparation methods of the medium include: (1) preparation of substrate layer, (2) preparation of magnetic antigen, (3) preparation of aseptic culture medium, and the amplification of hematopoietic stem cells in culture medium including: (1) the enrichment of hematopoietic stem cells and (2) hematopoietic stem cells. In vitro expansion and harvesting, (3) magnetic separation of hematopoietic stem cells. In conclusion, the invention can effectively increase the proliferation rate of hematopoietic stem cells in vitro, and has positive significance in drug research and clinical treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞因子组合物在体外培养造血干细胞中的应用
本专利技术属于生物工程和生物医药
，具体涉及一种细胞因子组合物在体外培养造血干细胞中的应用。
技术介绍
目前造血干细胞移植已经成为临床治疗血液病和恶性肿瘤的重要手段之一，由于脐血来源丰富、采集方便、免疫原性弱，较骨髓和外周血移植有更多优势。但是，脐血中造血干/祖细胞含量较低，难以满足成年及体重较大患者的需要，移植后造血重建延迟，很难收到满意的疗效，已严重限制其在临床中的应用。如何高效率地通过体外扩增的方法获取足量的造血干细胞以满足临床需要，已成为一个亟待解决的问题。既往研究显示：传统的细胞因子组合的体外扩增体系在促进造血干/祖细胞增殖的同时，也加快了其分化成熟的进程，丧失了造血干/祖细胞的自我更新及造血重建的潜能，无法维持长期造血；随着对造血微环境中调控造血干细胞增殖和自我更新的分子机制的认识为体外扩增造血干细胞提供了新的思路。在体内，造血微环境通过细胞间密切接触以及各类造血调控因子维持造血干细胞自我更新和多系分化的潜能。因此，模拟造血干细胞生长的微环境，成为了提高体外扩增效率重要方法之一。公开号为CN103509101A的公开了一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子，该细胞因子是由以下制备方法得到的，其包括如下步骤：(1)处理代基质细胞；(2)得到永生化细胞；(3)将(2)步筛选出的胎肝细胞连续传代，得到细胞系；(4)得到总RNA；(5)反转录成cDNA；(6)做基因芯片分析；(7)选取能刺激脐带血造血干细胞体外增殖的小鼠胎肝细胞中高表达的基因序列；(8)将(7)检索核苷酸序列；(9)得到293T细胞；(10)得到293T细胞相对应的蛋白；(11)将(10)纯化的蛋白添加到含有SCF,TPO,FLT3L,PTN的StemSpan培养基中，验证能促进脐带血造血干细胞的体外增殖。但是该专利所采用的是传统的血清培养基，由于血清来源于异种动物，成分不明，质量难以控制，且存在病毒感染、免疫排斥等风险。并且，造血干细胞的增殖倍数不高，对造血干细胞的分化抑制率低，并且存在对成功扩增的造血干细胞与其它干扰细胞不易分离的缺陷。
技术实现思路
针对以上技术问题，本专利技术提供一种细胞因子组合物在体外培养造血干细胞中的应用。本专利技术的技术方案为：一种细胞因子组合物在体外培养造血干细胞中的应用，所述细胞因子组合物是由主要成分和辅助成分以重量比例为10-20:1-3组成；所述主要成分按照重量百分比计包括：11.3-15.2％单核细胞趋化因子1、17.6-22.4％干细胞因子、9.1-14.4％白细胞介素-1β、5.8-8.6％血小板衍生因子、4.7-7.6％分化抑制因子，余量为白细胞介素6；所述血小板衍生因子对造血干细胞的集落培养中有定向分化成巨核细胞的作用，在体外扩增培养中与其他细胞因子组合可提高造血干细胞的增殖率和扩增倍数；所述干细胞因子是十分重要的早期造血干细胞的刺激因子；所述单核细胞趋化因子1可促进单核巨噬细胞的清道夫受体的表达；所述分化抑制因子能够抑制造血干细胞进一步分化。所述辅助成分按照重量百分比计包括：9.8-14.1％类胰岛素生长因子1、11.5-12.7％炎症细胞因子、7.2-10.1％低氧诱导因子、0.8-1.3％前列腺素介导部分生长因子、7.8-9.1％嗜酸性粒细胞趋化因子、14.8-20.2％细胞激活因子、6.7-8.4％小分子抑制剂，余量为人半乳糖凝集素1；所述类胰岛素生长因子1可以促进造血干细胞的增殖率；所述嗜酸性粒细胞趋化因子和炎症细胞因子可对造血干细胞在扩增过程中的增殖和分化进行微观调控；所述前列腺素介导部分生长因子具有促进造血干细胞分裂并还可起到一定的细胞保护作用；所述低氧诱导因子能够保证分裂扩增后的造血干细胞在移植到人体内能够适应低氧环境；所述细胞激活因子能够激活造血干细胞，促进其分裂；所述小分子抑制剂能够抑制造血干细胞进行分化；所述人半乳糖凝集素1可调控造血干细胞在移植到人体后的分化方向。进一步的，所述小分子抑制剂是基于SPOP蛋白结构的小分子抑制剂，所述SPOP蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示：进一步的，所述细胞因子组合物用于制造体外培养造血干细胞的培养基。进一步地，所述培养基按照重量百分比计包括：10.2-12.3％DMEM/F12基础培养基、6.8-7.9％细胞因子组合物、5.6-6.7％纳米磁珠、5.1-6.4％血管内皮细胞粘附因子、4.6-5.7％PBS缓冲液、0.3-0.8％rhVEGF、0.5-1.0％复合维生素、0.08-0.56％微量元素化合物、0.7-1.2％酪氨酸、0.8-1.3％缩氨酸、1.1-1.7％3D聚左旋乳酸、0.5-0.6％卵磷脂、0.1-0.3％小分子活性肽、0.05-0.10％茶多酚、1.0-2.0％人血红蛋白、3.3-4.1％水凝胶原蛋白胶、3.3-4.1％冰醋酸、3.4-4.5％人胎盘提取物、0.1-0.2％超氧化物歧化酶、0.1-0.3％多不饱和脂肪酸、0.01-0.03％泼尼松、0.01-0.03％黄体酮、0.2-0.3％传明酸，余量为超纯水；所述多不饱和脂肪酸用于维护细胞膜的结构和功能；所述泼尼松具有抗炎及抗过敏作用；所述人胎盘提取物中含有脐带血发育的天然活性成分，模拟了脐带血的体内发育微环境，可大大提高造血干细胞的扩增率；所述小分子活性肽可以原形直接进入细胞内，为造血干细胞提供丰富的营养物质；所述超氧化物歧化酶能够消除造血干细胞在分裂过程中自身产生的自由基；所述传明酸能够对抑制造血干细胞的分化起到一定的辅助作用。更进一步地，，所述复合维生素是由维生素A、维生素B6、维生素B4、维生素E以质量比为1:1:2:2组成的；所述复合维生素能够为造血干细胞提供营养，提高造血干细胞的活性。更进一步地，所述微量元素化合物为硒酵母、硫酸锌、二羧乙基三氧化二锗、氯化钙、氯化铁中任意一种或几种；所述硒酵母能够为造血干细胞提供微量元素硒，促进造血干细胞的分裂。进一步地，所述培养基的制备方法包括以下步骤：(1)制备培养底物层：将所述水凝胶原蛋白胶溶解于所述冰醋酸中，并将得到的溶解液利用0.22μm滤膜过滤，得到水凝胶原蛋白胶溶解液；然后再将所述水凝胶原蛋白胶溶解液以100l/μcm2的剂量装入培养滚瓶中，再将所述培养滚瓶密封后放入恒温培育箱内，在温度为40-45℃及转速为6-12r/h条件下贴壁孵育2h，得到培养底物层，待用；水凝胶原蛋白胶相较于胶原蛋白作为培养底物层，具有成较速率快、机械强度好、降解时间较长、免疫排异反应较弱等优点。(2)制备磁性抗原：所述纳米磁珠通过EDC/NHSS方式活化60min，得到活化纳米磁珠，再将所述活化纳米磁珠、血管内皮细胞粘附因子、PBS缓冲液按照上述比例进行混合，以30-60r/min机械搅拌30-40min，使得活化纳米磁珠与血管内皮细胞粘附因子进行特异结合，之后，加入所述rhVEGF，在37℃的CO2培养箱中培养4-6h，激活血管内皮细胞粘附因子，得到磁性抗原，用于与造血干细胞进行特异性黏附；(3)制备无菌培养基液：将所述细胞因子组合物、复合维生素、微量元素化合物、酪氨酸、缩氨酸、3D聚左旋乳酸、卵磷脂、小分子活性肽、茶多酚、人血红蛋白、人胎盘提取物、重组人本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞因子组合物在体外培养造血干细胞中的应用，其特征在于，所述细胞因子组合物是由主要成分和辅助成分以重量比例为10‑20:1‑3组成；所述主要成分按照重量百分比计包括：11.3‑15.2％单核细胞趋化因子1、17.6‑22.4％干细胞因子、9.1‑14.4％白细胞介素‑1β、5.8‑8.6％血小板衍生因子、4.7‑7.6％分化抑制因子，余量为白细胞介素6；所述辅助成分按照重量百分比计包括：9.8‑14.1％类胰岛素生长因子1、11.5‑12.7％炎症细胞因子、7.2‑10.1％低氧诱导因子、0.8‑1.3％前列腺素介导部分生长因子、7.8‑9.1％嗜酸性粒细胞趋化因子、14.8‑20.2％细胞激活因子、6.7‑8.4％小分子抑制剂，余量为人半乳糖凝集素1。

【技术特征摘要】
1.一种细胞因子组合物在体外培养造血干细胞中的应用，其特征在于，所述细胞因子组合物是由主要成分和辅助成分以重量比例为10-20:1-3组成；所述主要成分按照重量百分比计包括：11.3-15.2％单核细胞趋化因子1、17.6-22.4％干细胞因子、9.1-14.4％白细胞介素-1β、5.8-8.6％血小板衍生因子、4.7-7.6％分化抑制因子，余量为白细胞介素6；所述辅助成分按照重量百分比计包括：9.8-14.1％类胰岛素生长因子1、11.5-12.7％炎症细胞因子、7.2-10.1％低氧诱导因子、0.8-1.3％前列腺素介导部分生长因子、7.8-9.1％嗜酸性粒细胞趋化因子、14.8-20.2％细胞激活因子、6.7-8.4％小分子抑制剂，余量为人半乳糖凝集素1。2.如权利要求1所述的一种细胞因子组合物在体外培养造血干细胞中的应用，其特征在于，所述细胞因子组合物用于制造体外培养造血干细胞的培养基。3.如权利要求2所述的一种细胞因子组合物在体外培养造血干细胞中的应用，其特征在于，所述培养基按照重量百分比计包括：10.2-12.3％DMEM/F12基础培养基、6.8-7.9％细胞因子组合物、5.6-6.7％纳米磁珠、5.1-6.4％血管内皮细胞粘附因子、4.6-5.7％PBS缓冲液、0.3-0.8％rhVEGF、0.5-1.0％复合维生素、0.08-0.56％微量元素化合物、0.7-1.2％酪氨酸、0.8-1.3％缩氨酸、1.1-1.7％3D聚左旋乳酸、0.5-0.6％卵磷脂、0.1-0.3％小分子活性肽、0.05-0.10％茶多酚、1.0-2.0％人血红蛋白、3.3-4.1％水凝胶原蛋白胶、3.3-4.1％冰醋酸、3.4-4.5％人胎盘提取物、0.1-0.2％超氧化物歧化酶、0.1-0.3％多不饱和脂肪酸、0.01-0.03％泼尼松、0.01-0.03％黄体酮、0.2-0.3％传明酸，余量为超纯水。4.如权利要求3所述的一种细胞因子组合物在体外培养造血干细胞中的应用，其特征在于，所述复合维生素是由维生素A、维生素B6、维生素B4、维生素E以质量比为1:1:2:2组成的。5.如权利要求3所述的一种细胞因子组合物在体外培养造血干细胞中的应用，其特征在于，所述复合维生素是由维生素B6、维生素B4、维生素A、维生素E以质量比为1:2:1:2组成的。6.如权利要求3所述的一种细胞因子组合物在体外培养造血干细胞中的应用，其特征在于，所述微量元素化合物为硒酵母、硫酸锌、二羧乙基三氧化二锗、氯化钙、氯化铁中任意一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军，马玉春，李卓，
申请(专利权)人：大连金玛健康产业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21