一种反胶束萃取-脉冲电场联合分离提纯蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种反胶束萃取—脉冲电场联合分离提纯蛋白的方法，包括如下步骤：(1)将目标蛋白原料加入反胶束溶液中，混合均匀后转移至脉冲电场提取腔中，脉冲电场提取腔置于冷却槽中，进行脉冲电场联合联合反胶束萃取；(2)将步骤(1)处理后的脉冲电场提取腔中溶液进行固液分离，取上清液即得目标蛋白的前萃取液；(3)对所得前萃取液进行反萃取，得含目标蛋的后萃取液；(4)所得后萃取液浓缩干燥后即得目标蛋白。本发明专利技术能够提高蛋白的提取得率，缩短提取的时间，并且产品的品质也明显优于传统的提取方法。

A method for separation and purification of proteins by reverse micelles extraction and pulsed electric field

The invention discloses an anti micelle extraction pulse electric field combined separation and purification protein. The following steps are as follows: (1) the target protein material is added into the anti micelle solution, and then mixed evenly and transferred to the pulse electric field extraction cavity. The pulse electric field extraction cavity is placed in the cooling tank, and the pulsed electric field is combined with the combined back glue extraction. (2) ((1) step (1) treated pulse electric field extraction cavity solution for solid-liquid separation, take the supernatant to get the target protein extraction liquid; (3) the extraction liquid extraction liquid extraction, the extraction of the target egg after extraction solution; (4) after the extraction of the extract after drying, the target protein. The invention can improve the extraction rate of protein and shorten the time of extraction, and the quality of the product is obviously better than that of the traditional extraction method.

【技术实现步骤摘要】
一种反胶束萃取-脉冲电场联合分离提纯蛋白的方法
本专利技术涉及蛋白分离提纯
，具体涉及一种反胶束萃取—脉冲电场联合分离提纯蛋白的方法。
技术介绍
随着基因工程和细胞工程的发展，传统的溶剂萃取技术在抗生素等物质的生产中应用广泛，并显示出优良的分离性能，但难以应用于蛋白质的提取分离。一是大多数蛋白质不溶于有机溶剂，且接触有机溶剂后容易变形，二是蛋白质分子表面带的电荷多，普通离子缔合型萃取剂很难凑效。近年来，随着反胶束萃取技术的发展，为蛋白质分离提取技术提供了一个有较好开发前景的新工艺。反胶束是表面活性剂在非极性溶剂中形成的球形、椭圆形或棒形的纳米尺度聚集体(10-100nm)，形成水-表面活性剂-有机溶剂三相体系，是热力学稳定和透明体系，能够增溶水和亲水分子，在分离生物物质方面具有萃取条件温和，生产成本低，可规模化放大等特点。例如，公开号为CN102599326A的中国专利技术专利申请文献公开了一种大豆蛋白的萃取方法，特别是涉及一种反胶束萃取制备大豆蛋白的后萃方法，包括如下步骤：大豆粉碎，过80～120目筛、反胶束溶液的配制、反胶束前萃蛋白、在萃取压力为8-15MPa，萃取温度为40-50℃，二氧化碳流量为30-40L/h，萃取时间为1-2h下超临界后萃蛋白、蛋白的精制。公开号为CN101343309A的中国专利技术专利申请文献公开了一种利用反胶束萃取技术同时分离大豆蛋白和油脂的方法,包括以下步骤:(1)配置反胶束溶液；(2)将预处理过的大豆原料添加到反胶束溶液中,实现同时萃取其中的蛋白和油脂；(3)加入电解质溶液,使蛋白质从反胶束转移到水相中从而分离出蛋白质,实现蛋白的反萃取,得到蛋白水溶液和混合油；(4)然后再进行处理得到蛋白产品和油脂产品。目前该技术只能由于萃取一些小分子蛋白，如酶类、细胞色素C、牛血清蛋白(BSA)等，但对大分子蛋白的萃取能力还十分有限。主要的原因是混合反胶束体系虽然能够形成大的水池来容纳大分子蛋白，但是大蛋白分子进入胶束困难，缺少进入胶束内部的推动力。尤其是分离子型的表面活性剂在萃取时蛋白质的驱动力更小。
技术实现思路
本专利技术提供了一种反胶束萃取—脉冲电场联合分离提纯蛋白的方法，能够提高蛋白的提取得率，缩短提取的时间，并且产品的品质也明显优于传统的提取方法。一种反胶束萃取—脉冲电场联合分离提纯蛋白的方法，包括如下步骤：(1)将目标蛋白原料加入反胶束溶液中，混合均匀后转移至脉冲电场提取腔中，脉冲电场提取腔置于冷却槽中，进行脉冲电场联合联合反胶束萃取；(2)将步骤(1)处理后的脉冲电场提取腔中溶液进行固液分离，取上清液即得目标蛋白的前萃取液；(3)对所得前萃取液进行反萃取，得含目标蛋白的后萃取液；(4)所得后萃取液浓缩干燥后即得目标蛋白。反胶束的形成原理：将表面活性剂溶于非极性有机溶剂中，并使其浓度超过超临界胶束浓度(CMC)，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体就是反胶束。在反胶束中，表面活性剂的非极性集团在外与非极性有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核，此极性核形成了一个能够溶解蛋白的“水池”。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质水溶液接触后，蛋白质与其他亲水性物质进入该“水池”。由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，保持了待提取蛋白质的活性。反胶束法对提纯大分子蛋白具有一定的优势，但是由于蛋白分子扩散进胶束内部的推动力不足，本专利技术通过施加脉冲电场，从而为溶液中带电离子(胶束和蛋白质)提供一定的动能，促进了胶束和蛋白分子的碰撞，从而促使蛋白分子更容易进入到胶束的内部，实现了传质过程的强化。脉冲电场的核心作用是增强带电颗粒间的作用力，强化作用过程，形成较大的反胶束。增强蛋白质与反胶束间碰撞的机会，脉冲电场联合反胶束法提取蛋白的优势在于，能够提高蛋白的提取得率，缩短提取的时间，并且产品的品质也明显优于传统的提取方法。本专利技术中的反胶束萃取使用脉冲电场的作用跟脉冲电场辅助提取方法中脉冲电场的作用不同。脉冲电场辅助提取时，脉冲电场是使组织细胞发生穿孔，从而加速目标物质从组织细胞中溶出，减少高温或者高压的处理过程，提高提取效率和增强目标产物的活性。然而，本专利技术的反胶束萃取过程，使用脉冲电场的目的是：蛋白分子本身带有一定电荷，在脉冲电场作用下会因为电场力的作用而产生运动，促进了胶束和目标蛋白的碰撞，将目标蛋白分子挤入到亲水性物质的“水池”中，大大提高了过程的传质效率。与单纯使用反胶束萃取的方法相比，目标蛋白分子进入“水池”的速率和效率大大加强。此外，反胶束萃取使用脉冲电场跟反胶束萃取使用超声波的作用也不同，反胶束萃取使用超声波，超声波的空化作用在溶液中形成气泡，气泡的增长和破裂压缩过程形成了具有湍流特征的水力学激流，增大样品与萃取溶剂之间的接触面积，从而提高了传质速率。反胶束萃取使用超声萃取的劣势是，空化作用会对目标蛋白产生极强的剪切作用，导致目标蛋白结构上改变而发生破坏。而反胶束萃取采用脉冲电场时，只要控制好脉冲电场的强度和脉冲的宽度，就可以避免蛋白发生破坏。优选地，所述目标蛋白原料为菜籽粕、大豆粉或含有藻蓝蛋白的浓缩液。菜籽粕的预处理方法为：将菜籽粕放在通风处晾干，然后用粉碎机粉碎，过100目筛。大豆粉的制备方法为：大豆经除杂、去皮，破碎，软化、轧胚后制得大豆粉，过80目筛。含有藻蓝蛋白的浓缩液的制备方法为：将钝顶螺旋藻加水浸泡5小时后，在-20℃条件下冷冻2-3小时后再于20-25℃下融化，如此反复冻融3-4次实现对钝顶螺旋藻破壁处理。再将所得溶液离心处理，收集上清液即为含有藻蓝蛋白的粗提液，然后利用旋转蒸发器对粗提液进行浓缩即得。优选地，所述反胶束溶液为十二氨基磺酸钠/异辛烷反胶束体系、十六烷基三甲基溴化铵/正辛醇反胶束体系或丁二酸二异辛酯磺酸钠/异辛烷反胶束体系。十二氨基磺酸钠/异辛烷反胶束体系的配制方法为：称取8g十二氨基磺酸钠(SDS)，置于500mL锥形瓶中，加入100mL异辛烷，搅拌溶液使溶质完全溶解。放置10分钟后，加入0.08mol/L氯化钾缓冲溶液。震荡摇匀，然后将溶液放置于振荡器中震荡15分钟。十六烷基三甲基溴化铵/正辛醇反胶束体系的配制方法为：称取10g十六烷基三甲基溴化铵置于250mL锥形瓶中，然后加入100mL体积比为4:1的异辛烷/正丁醇溶液，再加入浓度为0.1mol/L氯化钾的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，用玻璃棒适当搅拌后放在振荡器上震荡溶解，形成透明的反胶束体系。丁二酸二异辛酯磺酸钠/异辛烷反胶束体系的配制方法为：称取10g丁二酸二异辛酯磺酸钠表面活性剂置于250mL锥形瓶中，然后加入100mL异辛烷溶液，再加入浓度为0.08mol/L氯化钾的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，用玻璃棒适当搅拌后放在振荡器上震荡溶解，形成透明的反胶束体系。优选地，反胶束溶液中目标蛋白原料的加入量为0.01g/mL～0.05g/mL。优选地，脉冲电场联合联合反胶束萃取的条件为：调节高低压电极间距为3～5mm，接通双极性脉冲电源，脉冲宽度200ns-2μsns，电场强度5-30kkV/cm，脉冲频率10-500Hz，处理时间为4～6分钟。进一步优选地，脉冲电场联合联合反胶束萃取的条件为：调节高低压电极间距为3～5mm，接通双极性脉冲电源本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种反胶束萃取‑脉冲电场联合分离提纯蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将目标蛋白原料加入反胶束溶液中，混合均匀后转移至脉冲电场提取腔中，脉冲电场提取腔置于冷却槽中，进行脉冲电场联合反胶束萃取；(2)将步骤(1)处理后的脉冲电场提取腔中溶液进行固液分离，取上清液即得目标蛋白的前萃取液；(3)对所得前萃取液进行反萃取，得含目标蛋的后萃取液；(4)所得后萃取液浓缩干燥后即得目标蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种反胶束萃取-脉冲电场联合分离提纯蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将目标蛋白原料加入反胶束溶液中，混合均匀后转移至脉冲电场提取腔中，脉冲电场提取腔置于冷却槽中，进行脉冲电场联合反胶束萃取；(2)将步骤(1)处理后的脉冲电场提取腔中溶液进行固液分离，取上清液即得目标蛋白的前萃取液；(3)对所得前萃取液进行反萃取，得含目标蛋的后萃取液；(4)所得后萃取液浓缩干燥后即得目标蛋白。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述目标蛋白原料为菜籽粕、大豆粉或含有藻蓝蛋白的浓缩液。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述反胶束溶液为十二氨基磺酸钠/异辛烷反胶束体系、十六烷基三甲基溴化铵/正辛醇反胶束体系或丁二酸二异辛酯磺酸钠/异辛烷反胶束体系。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，反胶束溶液中目标蛋白原料的加入量为0.01g/mL～0.05g/mL。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，脉冲电场采用双极性脉冲电源。6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，脉冲电场联合联合反胶束萃取的条件为：调节高低压电极间距为...

【专利技术属性】
技术研发人员：章志成，袁玲，姚俊，孔庆娜，
申请(专利权)人：台州学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33