一种治疗柑橘黄龙病的多粘类芽孢杆菌培养液复合药物及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种以多粘类芽孢杆菌培养液为主要成分的柑橘黄龙病治疗药物，其组成为多粘类芽孢杆菌培养液10％、苯乳酸0.02％、MS培养基50％、水39.98％、pH为6.0。多粘类芽孢杆菌培养液配方为豆粕10克/升、微晶纤维素5克/升、硫酸镁0.1克/升、硫酸锰0.1克/升、pH＝7.0，培养条件为28℃、摇床转速220转/分钟、培养48小时。本发明专利技术采用微晶纤维素作为唯一培养碳源，诱导了β‑葡聚糖酶的生物合成，培养液中其酶活达到了261IU/mL，以该培养液为主，苯乳酸和MS为辅的药物对柑橘进行治疗，荧光定量PCR检测结果表明显著减少柑橘黄龙病病菌在病株中的含量以及黄龙病的康复。

Compound medicine of Bacillus cereus culture liquid for treating citrus Huanglong disease and preparation method thereof

The invention relates to a citrus yellow dragon disease treatment drug with Bacillus spore bacillus culture medium as the main component, which consists of Bacillus viscocibacilli culture medium 10%, benzoate 0.02%, MS medium 50%, water 39.98%, and pH 6. The formula of Bacillus spore bacillus culture medium was 10 grams / liter of soybean meal, 5 grams / liter of microcrystalline cellulose, 0.1 grams / liter of Magnesium Sulfate, 0.1 g / L of manganese sulfate, pH = 7, 28 centigrade culture condition, 220 rotating speed of rocking bed, and 48 hours for culture. The invention uses microcrystalline cellulose as the only culture carbon source to induce the biosynthesis of beta glucan glucan enzyme. The enzyme activity in the culture medium is 261IU/mL. The citrus is treated with the culture medium, benzene lactic acid and MS supplemented. The fluorescence quantitative PCR detection result table obviously reduces the citrus yellow dragon disease pathogen in the disease strain. The content of the disease and the recovery of Huanglong disease.

【技术实现步骤摘要】
一种治疗柑橘黄龙病的多粘类芽孢杆菌培养液复合药物及其制备方法
本专利技术涉及一种以多粘类芽孢杆菌培养液为主要成分的柑橘黄龙病治疗药物，属于生物

技术介绍
柑橘黄龙病是一种柑橘类植物的毁灭性病害，目前还没有效的抑制药剂。该病害的致病菌是一种迄今尚不能人工培养的韧皮部杆菌属细菌(CandidatusLiberibacter)。该病害防治的难点在于，致病菌无法获得人工培养，因为缺少该病害的目标菌，故无法筛选出针对性的杀菌药剂。目前对该病害的防治均使用一种或几种复配的抗生素类的杀菌药剂，此类药剂具有广谱杀菌性，对植物和环境生态破坏严重，目前实际使用中效果不理想。植物内生菌在高等植物中普遍存在。由于植物内生菌和植物存在着共生关系，因此有关植物内生菌的研究正成为国内外环境、生物防治等领域的热点。虽然柑橘黄龙病菌无法培养，但是可以找到其伴生菌，以黄龙病菌的伴生菌为筛选抑菌药物的指示菌，此种方法可以有目的性的筛选出有效的抑菌药剂。通过该方法筛选出的抑菌剂存在专有性，通过杀灭黄龙病菌的伴生菌改变了植物微生态坏境，而植物微生态坏境的改变可以抑制黄龙病菌的生长、繁殖，从而达到杀灭该病菌的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种以多粘类芽孢杆菌培养液为主要成分的柑橘黄龙病治疗药物，通过杀灭黄龙病菌的伴生菌来抑制黄龙病菌的生长、繁殖。本专利技术采用的技术方案为：一种柑橘黄龙病治疗药物，其制备方法为：首先制备多粘类芽孢杆菌培养液，其培养基成分为豆粕10克/升、微晶纤维素5克/升、硫酸镁0.1克/升、硫酸锰0.1克/升、pH＝7.0，接种1毫升多粘类芽孢杆菌菌种至200毫升上述培养基，培养条件为28℃、摇床转速220转/分钟、培养48小时。培养48小时后，采用20000g的离心力对培养液离心，取离心上清100克、加入0.2克苯乳酸、加入500毫升MS培养基、用去离子水调配至1000mL并调节pH为6.0，混匀，即可。所述柑橘黄龙病治疗药物采用树干输液的方法施药。本专利技术以黄龙病菌的伴生菌为指示菌筛选出以富含β-葡聚糖酶的多粘类芽孢杆菌培养液为主的药剂，苯乳酸和MS培养基为辅助成分，在无法获得人工培养致病菌的情况下，这是柑橘黄龙病害防治的一条有效途径。苯乳酸作为一种发酵有机酸，存在于天然蜂蜜中，是一种新型的小分子抗菌物质，对抑制霉菌、腐败菌上有相关的研究，主要用在食物保鲜。对于果树内生菌的抑菌研究未见报导，对本专利中涉及的细杆菌属(Microbacterium)、代尔夫特菌属(Delftia)，不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)，5个菌株未见相关的抑菌研究和应用。本专利技术的优点在于：多粘类芽孢杆菌培养液中富含β-葡聚糖酶，β-葡聚糖酶参与植物的免疫反应，可以和几丁质酶协同抑制真菌和某些细菌的生长。微生物细胞壁主要由葡聚糖结构的高分子组成，在β-葡聚糖酶的作用下降解微生物细胞壁，造成细胞质流失，最终抑制微生物的生长。苯乳酸是通过发酵获得的天然有机酸，存在于天然蜂蜜中，所以有良好的亲自然性，对环境无不良影响。苯乳酸是一种小分子抗菌物质，对多种革兰氏阳性、阴性细菌均有很好的抗菌活性。由于抗生素类药物易导致病原菌产生抗药性，而有机酸则不会。MS培养基富含植物所需的各种大量元素以及微量成分，可以为植物提供充足的能量、代谢所需的辅助成分。所述柑橘黄龙病治疗药物制备工艺简单、成本低，可显著抑制柑橘病树中的黄龙病菌，对柑橘黄龙病的防治效果显著。同时具有有良好的亲自然性，对环境无不良影响。附图说明图1为实施例1-4制得的多粘类芽孢杆菌培养液中β-葡聚糖酶活。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1：一种多粘类芽孢杆菌培养液制备方法为：培养基成分为豆粕10克/升、微晶纤维素5克/升、硫酸镁0.1克/升、硫酸锰0.1克/升、pH＝7.0，接种1毫升多粘类芽孢杆菌菌种(美国标准生物品收藏中心ATCC7070)至200毫升上述培养基，培养条件为28℃、摇床转速220转/分钟、培养48小时。培养48小时后，采用20000g的离心力对培养液离心，取离心上清100克、加入0.2克苯乳酸、加入500毫升MS培养基、用去离子水调配至1000mL并调节pH为6.0，混匀，即可(药剂1)。所述柑橘黄龙病抑菌剂采用树干输液的方法施药。实施例2：一种多粘类芽孢杆菌培养液制备方法为：培养基成分为豆粕10克/升、蔗糖5克/升、硫酸镁0.1克/升、硫酸锰0.1克/升、pH＝7.0，接种1毫升多粘类芽孢杆菌菌种(美国标准生物品收藏中心ATCC7070)至200毫升上述培养基，培养条件为28℃、摇床转速220转/分钟、培养48小时。培养48小时后，采用20000g的离心力对培养液离心，取离心上清100克、加入0.2克苯乳酸、加入500毫升MS培养基、用去离子水调配至1000mL并调节pH为6.0，混匀，即可(药剂2)。所述柑橘黄龙病抑菌剂采用树干输液的方法施药。实施例3：一种多粘类芽孢杆菌培养液制备方法为：培养基成分为豆粕10克/升、蔗糖5克/升、硫酸镁0.1克/升、硫酸锰0.1克/升、pH＝7.0，接种1毫升多粘类芽孢杆菌菌种(美国标准生物品收藏中心ATCC7070)至200毫升上述培养基，培养条件为28℃、摇床转速220转/分钟、培养48小时。培养48小时后，采用20000g的离心力对培养液离心，取离心上清100克、加入500毫升MS培养基、用去离子水调配至1000mL并调节pH为6.0，混匀，即可(药剂3)。所述柑橘黄龙病抑菌剂采用树干输液的方法施药。实施例4：一种多粘类芽孢杆菌培养液制备方法为：培养基成分为胰蛋白10克/升、蔗糖5克/升、硫酸镁0.1克/升、硫酸锰0.1克/升、pH＝7.0，接种1毫升多粘类芽孢杆菌菌种(美国标准生物品收藏中心ATCC7070)至200毫升上述培养基，培养条件为28℃、摇床转速220转/分钟、培养48小时。培养48小时后，采用20000g的离心力对培养液离心，取离心上清100克、加入500毫升MS培养基、用去离子水调配至1000mL并调节pH为6.0，混匀，即可(药剂4)。所述柑橘黄龙病抑菌剂采用树干输液的方法施药。实施例5：脐橙果树内生菌抑菌实验试验用果树均来自江西赣州赣县果园(E115°12′N26°04′)，随机采取病植株和健康植株的果树枝叶，将果树枝叶处理后，用NB、LB和果树汁液的混合培养基分别进行培养，经过多次摇瓶、涂布、划线培养后，获得7株果树内生菌，进行菌种鉴定，其中edft1#菌株是代尔夫特菌属(Delftia)，edft2#、edft3#菌株是不动杆菌属(Acinetobacter)，edft4#、edft5#菌株是细杆菌属(Microbacterium)，edft6#菌株假单胞菌(Pseudomonas)，edft7#伯克霍尔德菌属(Burkholderia)。用实施例1-4制得的柑橘黄龙病抑菌剂(以下描述为：药剂1、药剂2、药剂3、药剂4)和盐酸四环素分别对7种内生菌做抑菌实验。通过对健康、患病果树内生菌高通量测序，比对现有数据发现，代尔夫特菌属(Delftia)和伯克霍尔德菌属(Burkholder本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柑橘黄龙病治疗药物，其特征在于：制备方法为：首先制备多粘类芽孢杆菌培养液，其培养基成分为豆粕10克/升、微晶纤维素5克/升、硫酸镁0.1克/升、硫酸锰0.1克/升、pH＝7.0，接种1毫升多粘类芽孢杆菌菌种至200毫升上述培养基，培养条件为28℃、摇床转速220转/分钟、培养48小时；培养48小时后，采用20000g的离心力对培养液离心，取离心上清100克、加入0.2克苯乳酸、加入500毫升MS培养基、用去离子水调配至1000mL并调节pH为6.0，混匀，即可。

【技术特征摘要】
1.一种柑橘黄龙病治疗药物，其特征在于：制备方法为：首先制备多粘类芽孢杆菌培养液，其培养基成分为豆粕10克/升、微晶纤维素5克/升、硫酸镁0.1克/升、硫酸锰0.1克/升、pH＝7.0，接种1毫升多粘类芽孢杆菌菌种至200毫升上述培养基，培养条件为28℃、摇床转速220转/分钟、培养48...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊大维，金丹凤，黄国昌，顾斌涛，李鹏，黄筱萍，刘兰，
申请(专利权)人：江西省科学院微生物研究所，江西绿悦生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36