蚕蛹抗氧化肽的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了蚕蛹抗氧化肽的分离纯化方法，该分离纯化方法的具体步骤为：将蚕蛹蛋白酶解产物溶于双蒸水中，离心后上清液即为蚕蛹抗氧化肽粗液；将蚕蛹蛋白肽液溶于双蒸水，离心后上清液加入到离子交换树脂层析柱，洗脱，收集对ACE抑制活性最好的抗氧化肽，即为离子交换层析酶解物；将离子交换层析酶解物溶于双蒸水，离心后上清液经过葡聚糖凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分；将上述凝胶层析酶解物溶于双蒸水，利用高效液相色谱进行纯化，即得蚕蛹抗氧化肽。有益效果为：本发明专利技术分离方法简单，可快速高效地分离出抗氧化肽，抗氧化肽得率高、损失低、纯度高、活性不被破坏，得到的抗氧化肽对ACE抑制活性好。

Isolation and purification of antioxidant peptides from silkworm chrysalis

The method of separation and purification of antioxidation peptide of silkworm chrysalis is disclosed. The specific step of the separation and purification method is as follows: the hydrolysates of the silkworm pupae are dissolved in double steam water, the supernatant after centrifugation is the crude liquid of the antioxidant peptide of silkworm chrysalis, and the liquid of the silkworm pupa protein peptide is dissolved in the double steam water, and the supernatant after centrifugation is added to the ion exchange resin chromatography column. Elution, the best antioxidation peptide for ACE was collected, that is, ion exchange chromatography enzyme solution; the ion exchange chromatography enzyme solution was dissolved in double water, the supernatant after centrifugation was separated by dextran gel column chromatography, eluted with double steam water, and the elution components were collected according to the absorbance curve under 280nm; the gel chromatography was used. The hydrolysate was dissolved in double distilled water and purified by high performance liquid chromatography, so that the antioxidant peptide of silkworm chrysalis was obtained. The beneficial effect is as follows: the separation method of the invention is simple, the antioxidant peptide can be separated quickly and efficiently, the yield of the antioxidant peptide is high, the loss is low, the purity is high, the activity is not destroyed, and the antioxidation peptide has good inhibitory activity to the ACE.

【技术实现步骤摘要】
蚕蛹抗氧化肽的分离纯化方法
本专利技术涉及多肽提取
，尤其是涉及蚕蛹抗氧化肽的分离纯化方法。
技术介绍
中国是著名丝绸古国，“丝绸之路”闻名与此，自古以来蚕桑业在中国的农业中都是重要的部分，远在七千多年前我国就有养蚕抽丝的记载。目前，世界80%的产丝量都是由我国产出。蚕蛹蛋白是一种优质蛋白资源，蛋白质的含量在干蚕蛹中高达50%左右，富含丰富的氨基酸，其中8种必需氨基酸占到总量45%左右，而必需氨基酸和非必需氨基酸是合理的，平衡的，其质量比为0.73，符合世界卫生组织/联合国粮食及农业组织（WHO/FAO）提出的参考蛋白模式，所以蚕蛹蛋白具有十分高的营养价值。我国是一个养蚕大国，平均每年新鲜蚕蛹的产量可达50万吨，蚕蛹中的蛋白比很多畜禽类的必需氨基酸含量高，其中富含具有可以促进生长发育、提高免疫力以及补充生物机体营养等功能的很多营养物质，具有巨大的市场潜力。但是由于我国长期以来对蚕蛹方面的加工利用率低下，除了干蚕蛹粉碎后应用于畜禽饲料和营养源添加外，甚至有些蚕蛹被当做肥料或者直接废弃掉，因此，造成了巨大的资源浪费。随着社会的技术和桑蚕生产的增加，蚕蛹和深入的研究和开发的综合利用已成为必须解决的问题。随着科技的发展，人们对蚕蛹蛋白的研究将更加多样化，将不断的开发出蚕蛹蛋白在食品（例如酸性饮料、肽类保健品、蚕蛹生抽等）、医药、化工、农业等行业更多应用，渗透到各个领域中，为综合利用蚕蛹、发展桑业，为国家GDP的增长贡献出一份力量。其中以蚕蛹蛋白粉为原料，采用酶解方法制备的蚕蛹蛋白肽为蚕蛹蛋白的进一步利用提供了一个方向。现有技术如授权公告号为CN103520078B的中国专利技术专利，公开了蚕蛹多肽及其制备方法、应用，多肽2的制备方法，其步骤包括（1）煎煮，（2）酶解，（3）蛋白质分离，（4）半制备RP-HPLC分离纯化，（5）冻干。上述酶解采用中性蛋白酶、复合蛋白酶酶解。上述蛋白质分离采用大孔树脂、葡聚糖凝胶。上述蚕蛹多肽2是从蚕蛹中提取多肽，安全性好，而且能有效的预防或治疗糖尿病。但是该蚕蛹多肽2的分离提纯效果不好。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种分离方法简单，可快速高效地分离出抗氧化肽，抗氧化肽得率高、损失低、纯度高、活性不被破坏，与最初的酶解物相比，所得抗氧化肽清除自由基和保护细胞免受氧化损伤的能力大大提高的分离纯化方法。本专利技术针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：蚕蛹抗氧化肽的分离纯化方法，包括蚕蛹抗氧化肽粗液制备、凝胶柱层析、离子交换树脂层析、高效液相色谱纯化，其具体步骤为：蚕蛹抗氧化肽粗液制备：将蚕蛹蛋白酶解产物溶于双蒸水配成浓度为20-30mg/mL的溶液，然后在温度为1-5℃、转速为10000-13000rpm的离心机中离心5-10min，上清液即为蚕蛹抗氧化肽粗液，备用，该蚕蛹抗氧化肽粗液中成分较为复杂，因为其分子量和氨基酸序列不同而具有不同的物理特性和生物活性，为了得到抗氧化肽，必须将其分离纯化；凝胶柱层析：将葡聚糖凝胶用去离子水在沸水浴中加热溶胶1-3h，然后与去离子水按照重量比为2.5-3.5:1混合均匀，然后灌入柱子中，填装好的凝胶柱经平衡后，将蚕蛹抗氧化肽粗液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，设置检测器灵敏度为0.2A，检测器调至280nm处检测，进样量1.8-2.2mL，流速为0.5-0.8mL/min，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，冷冻干燥，备用，该方法根据酶解液在层析柱中的移动速度不同，大分子的组分先被洗脱下来，小分子的组分后被洗脱下来，从而达到分离纯化的目的，操作简便，且不需要抗氧化肽与其他物质结合，减少了纯化过程中抗氧化肽的损失，不影响目标组分化学性质，能保持抗氧化肽原有的活性不受破坏；离子交换树脂层析：将凝胶柱层析步骤得样品用双蒸水配成浓度为45-55mg/mL的溶液，然后在温度为1-5℃、转速为10000-13000rpm的离心机中离心5-10min，去除不溶性杂质，上清液加入到DEAE-52阴离子交换树脂层析柱，依次用双蒸水、0.1、0.5和1M的NaCl溶液洗脱，收集自由基清除活性最强组分，即为离子交换层析酶解物，该方法根据目标物质所带净电荷的不同，将目标物质分离出来，具有重复性好、操作简单、洗脱范围广的优势，可根据实际情况进行放大条件实现工业化生产；高效液相色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80-100μg/mL的溶液，利用高效液相色谱进行纯化，即得蚕蛹抗氧化肽，色谱条件为：设置进样量为4-6μL、色谱柱为AgilentC18（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为25-35℃、流动相为10-15%乙腈溶液、洗脱速度为0.8-1.2mL/min，该方法具有分析速度快、分辨率高、灵敏度高、分离效果好的优势，能快速分离纯化目标物质，同时该纯化步骤所需样品量少，进样量以µL为数量级，可同时分离多种成分，能反复进样，且分离过程中样品不被破坏，易回收，获得的组分纯度较高。优选的，凝胶柱层析步骤中葡聚糖凝胶为改性葡聚糖凝胶，其改性方法为：按摩尔比为1:0.8-1.2:0.013-0.016将葡聚糖凝胶中加入NaIO4和2,6-二氯苯甲酸，再加入与NaIO4等摩尔的25-35%H2O2溶液，在55-65℃下反应2-3h，冷却，用去离子水洗净，抽滤，真空干燥以后，得到改性葡聚糖凝胶，NaIO4和2,6-二氯苯甲酸能够发挥协同作用，使得NaIO4能够快速氧化形成羧基，使得酸分子更容易与凝胶分子接近，使氧化反应更容易进行，更易于改性葡聚糖凝胶的生产，提高了反应速率和取代度，增加葡聚糖凝胶上的亲水性功能基团-羧基，进而提高葡聚糖凝胶的吸水溶胀量，使得目标物质进入凝胶的微孔内，增加目标物质的流经路程，最终使得目标物质的纯度较高，同时可避免羧基和羟基发生内酯反应等副反应的发生，避免形成链间酯，提高改性葡聚糖凝胶的吸水量，使得葡聚糖凝胶溶于水后能直接使用，减少分离的步骤，此外该葡聚糖凝胶溶胀与皱缩过程要快，与溶液分离容易，易于再生，强度好，使用寿命长。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术分离纯化方法分离方法简单，可快速高效地分离出抗氧化肽，使得抗氧化肽得率高、损失低、纯度高、活性不被破坏，与最初的酶解物相比，所得抗氧化肽清除自由基和保护细胞免受氧化损伤的能力大大提高；该制备方法中凝胶柱用葡聚糖凝胶的亲水性功能基团-羧基较多，吸水溶胀量较高，能够增加目标物质的流经路程，最终使得目标物质的纯度较高，且溶胀与皱缩过程要快，与溶液分离容易，易于再生，强度好，使用寿命长。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：蚕蛹抗氧化肽的分离纯化方法，包括蚕蛹抗氧化肽粗液制备、凝胶柱层析、离子交换树脂层析、高效液相色谱纯化，其具体步骤为：1）蚕蛹抗氧化肽粗液制备：将蚕蛹蛋白酶解产物溶于双蒸水配成浓度为30mg/mL的溶液，然后在温度为1℃、转速为13000rpm的离心机中离心5min，上清液即为蚕蛹抗氧化肽粗液，备用，该蚕蛹抗氧化肽粗液中成分较为复杂，因为其分子量和氨基酸序列不同而具有不同的物理特性和生物活性，为了得到抗氧化肽，必须将其分离纯化；2）凝胶柱层析：将葡聚糖凝胶用去离子水在沸水浴中加热溶胶3h，然后与去离子水按照重量比为2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蚕蛹抗氧化肽的分离纯化方法，包括蚕蛹抗氧化肽粗液制备、超滤分离、凝胶柱层析、离子交换树脂层析、高效液相色谱纯化，其特征在于：所述凝胶柱层析步骤中聚糖凝胶为改性葡聚糖凝胶，其改性方法为：将葡聚糖凝胶中加入NaIO4和2,6‑二氯苯甲酸，再加入H2O2溶液，反应，冷却，用去离子水洗净，抽滤，干燥，得到改性葡聚糖凝胶。

【技术特征摘要】
1.蚕蛹抗氧化肽的分离纯化方法，包括蚕蛹抗氧化肽粗液制备、超滤分离、凝胶柱层析、离子交换树脂层析、高效液相色谱纯化，其特征在于：所述凝胶柱层析步骤中聚糖凝胶为改性葡聚糖凝胶，其改性方法为：将葡聚糖凝胶中加入NaIO4和2,6-二氯苯甲酸，再加入H2O2溶液，反应，冷却，用去离子水洗净，抽滤，干燥，得到改性葡聚糖凝胶。2.根据权利要求1所述的蚕蛹抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于：所述葡聚糖凝胶、NaIO4和2,6-二氯苯甲酸的摩尔比为1:0.8-1.2:0.013-0.016。3.根据权利要求1所述的蚕蛹抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于：所述H2O2溶液的浓度为25-35%，所述H2O2溶液和NaIO4等摩尔。4.根据权利要求1所述的蚕蛹抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于：所述反应温度为55-65℃、时间为2-3h。5.根据权利要求1所述的蚕蛹抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于：所述凝胶柱层析步骤为：将葡聚糖凝胶用去离子水在沸水浴中加热溶胶1-3h，然后与去离子水按照重量比为2.5-3.5:1混合均匀，然后灌入柱子中，填装好的凝胶柱经平衡后，将蚕蛹抗氧化肽粗液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，设置检测器灵敏度为0.2A，检测器调至280nm处...

【专利技术属性】
技术研发人员：董珊珊，
申请(专利权)人：海盐县凌特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33