基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法技术

基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，根据长毛明对虾和凡纳滨对虾线粒体基因组全序列，设计扩增细胞色素C氧化酶I(COI)基因片段的引物COIF和COIR；提取长毛明对虾和凡纳滨对虾的基因组DNA，利用引物COIF和COIR进行PCR反应；将PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，测序验证；利用MEGA7.0比对获得的序列，利用DNAMAN预测各种对虾代表序列的酶切位点；取待放流的长毛明对虾F1代仔虾和亲虾，提取基因组DNA；利用COIF和COIR，对DNA模板F1～F4，P1～P4，V1，V2，Y1，Y2，V1+Y1，V2+Y2进行PCR扩增，将PCR扩增产物酶切，酶切产物进行电泳鉴定。

【技术实现步骤摘要】
基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法
本专利技术涉及种质鉴定方法，尤其是涉及一种基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法。
技术介绍
近年来，由于过度捕捞和环境污染，我国近海岸生态系统受到严重破坏，导致渔业资源逐渐枯竭。渔业资源增殖放流是指通过向渔业资源出现衰退的天然水域投放鱼、虾、蟹、贝等苗种，使其自然种群数量和资源总量得以恢复的一种有效方法(陈睿毅,楼宝,詹炜,等.人工增殖放流技术的探讨[J].河北渔业,2014(5):50-54)。增殖放流不仅有利于恢复渔业种群资源、保护濒危物种、改善水域生态环境，并且能够促进渔业增效、提高渔民的经济收入，同时也是我国社会主义生态文明建设的需要。近年来，各级政府部门增加对渔业生物资源的投入，逐年扩大人工增殖放流范围的和放流物种种类、数量，已经取得了一定的经济效益(梁君.海洋渔业资源增殖放流效果的主要影响因素及对策研究[J].中国渔业经济,2013,31(5):122-134)。但许多增殖放流项目的效果并不显著，存在许多不规范的问题，比如放流苗种不纯正甚至掺假；放流操作不规范；放流苗种缺乏疾病检测等。所有这些环节都会影响到渔业增殖放流的效果，甚至影响野生种群的遗传多样性。其中放流苗种的来源是首要问题。目前，对虾的增殖放流一般规格为10mm(仔虾)，不同种对虾虾苗在形态上难以区分，不乏一些唯利是图的商人以假乱真，以次充好。目前还没有一种有效快捷的方法用于鉴定放流虾苗是否存在掺杂。DNA条形码(DNABarcoding)是指通过分析一段标准的DNA序列对物种进行鉴定(WaughJ.DNAbarcodinginanimalspecies:progress,potentialandpitfalls.[J].BioessaysNews&ReviewsinMolecularCellular&DevelopmentalBiology,2007,29(2):188)。在动物种级水平的物种鉴定中，常用线粒体基因如细胞色素C氧化酶I基因(COI)和16SrRNA等。长毛明对虾(Fenneropenaeuspenicillatus)作为我国重要的海洋经济虾类，近年来受环境变化的影响，资源量急剧下降，在《中国物种红色名录》(2005版)中被列为濒危物种。福建省近十多年来一直开展增殖放流活动，其中对虾品种主要是长毛明对虾，增殖放流成效初显。保证长毛明对虾虾苗的纯正是科学有目的地进行增殖放流的前提，也是改善长毛明对虾野生资源所必需。利用DNA条形码技术可以准确、快速鉴定放流长毛明对虾虾苗中是否掺杂凡纳滨对虾。
技术实现思路
本专利技术目的是提供可准确、高效地完成放流长毛明对虾虾苗快速鉴定的基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法。本专利技术首先利用细胞色素C氧化酶I(COI)基因通用引物(F:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，R:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)分别扩增10尾凡纳滨对虾和长毛明对虾，利用MEGA7.0比对获得的序列，同时利用DNAMAN(Version9.0)预测各种对虾代表序列的酶切位点。所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，包括以下步骤：1)根据长毛明对虾(NC_026885.1)和凡纳滨对虾(NC_009626.1)线粒体基因组全序列，设计扩增细胞色素C氧化酶I(COI)基因片段的引物COIF和COIR；2)提取长毛明对虾和凡纳滨对虾的基因组DNA，利用引物COIF和COIR进行PCR反应；3)将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并测序验证；4)利用MEGA7.0比对获得的序列，同时利用DNAMAN(Version9.0)预测各种对虾代表序列的酶切位点；5)取待放流的长毛明对虾F1代仔虾和亲虾，分别提取基因组DNA；6)利用COIF和COIR，对DNA模板F1～F4，P1～P4，V1，V2，Y1，Y2，V1+Y1(1︰1)，V2+Y2(1︰1)进行PCR扩增，再将所述的PCR扩增产物进行酶切，酶切产物进行电泳鉴定。在步骤1)中，所述引物可为：COIF：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；COIR：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。在步骤2)中，所述提取长毛明对虾和凡纳滨对虾的基因组DNA，可提取10尾长毛明对虾和10尾凡纳滨对虾的基因组DNA；所述长毛明对虾为Y1～Y10，所述凡纳滨对虾为V1～V10；所述提取的长毛明对虾和凡纳滨对虾的DNA，可采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒DP324，天根产；所述PCR反应体系为：12.5μl2×EasyTaqPCRSuperMix(-dye)，1μlCOIF，1μlCOIR，1μlDNA，ddH2O补充至25μl。所述PCR反应程序为：①94℃3min；②40个循环：94℃1min，41℃1min15s，72℃1min30s；③72℃10min；所述长毛明对虾的PCR扩增产物序列为：所述凡纳滨对虾的PCR扩增产物序列为：其中，A/AGCTT为酶切位点；所述酶切位点可使用HindIII内切酶；所述电泳可采用琼脂糖凝胶电泳；长毛明对虾和凡纳滨对虾经PCR扩增的产物片段长度为663bp。凡纳滨对虾存在酶切位点AAGCTT，经酶切产生379bp和284bp酶切片段；在长毛明对虾中不存在该酶切位点，故仍存在663bp的条带，若长毛明对虾虾苗中掺杂凡纳滨对虾，则会出现663bp，379bp和284bp3条片段。在步骤3)中，所述将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，可将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳1％检测。在步骤5)中，所述取待放流的长毛明对虾F1代仔虾和亲虾，可取厦门翔安欣星海水产养殖专业合作社待放流的4口水泥池的长毛明对虾F1代仔虾和4尾亲虾；所述4口水泥池的长毛明对虾F1代仔虾为F1，F2，F3，F4；所述4尾亲虾为P1，P2，P3，P4。本专利技术利用存在于凡纳滨对虾和长毛明对虾之间的单核苷酸突变位点AA(G/A)CT(T/C)，构建出能正确区分2种对虾的酶切图谱，从而建立了准确、快速地鉴定长毛明对虾虾苗中是否掺杂凡纳滨对虾的PCR-RFLP方法。附图说明图1是采样仔虾(F1-F4)和采样亲虾(P1-P4)，凡纳滨对虾(V1,V2)，长毛明对虾(Y1,Y2)，及其混合模板(V1+Y1)和(V2+Y2)PCR扩增COI序列后的电泳图谱。DNAMarkerDL2000(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)。图2是图1中相应的PCR产物HindIII酶切后的电泳图谱。具体实施方式以下实施例将结合附图进一步说明本专利技术。1)根据已知的长毛明对虾线粒体基因组全序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_026885.1)和凡纳滨对虾线粒体基因组全序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_009626.1)，设计1对扩增细胞色素C氧化酶I(COI)基因片段的引物COIF和COIR如下：COIF：5’-GGTCAAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：1)根据长毛明对虾(NC_026885.1)和凡纳滨对虾(NC_009626.1)线粒体基因组全序列，设计扩增细胞色素C氧化酶I(COI)基因片段的引物COIF和COIR；2)提取长毛明对虾和凡纳滨对虾的基因组DNA，利用引物COIF和COIR进行PCR反应；3)将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并测序验证；4)利用MEGA7.0比对获得的序列，同时利用DNAMAN(Version9.0)预测各种对虾代表序列的酶切位点；5)取待放流的长毛明对虾F1代仔虾和亲虾，分别提取基因组DNA；6)利用COIF和COIR，对DNA模板F1～F4，P1～P4，V1，V2，Y1，Y2，V1+Y1(1︰1)，V2+Y2(1︰1)进行PCR扩增，再将所述的PCR扩增产物进行酶切，酶切产物进行电泳鉴定。

【技术特征摘要】
1.基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：1)根据长毛明对虾(NC_026885.1)和凡纳滨对虾(NC_009626.1)线粒体基因组全序列，设计扩增细胞色素C氧化酶I(COI)基因片段的引物COIF和COIR；2)提取长毛明对虾和凡纳滨对虾的基因组DNA，利用引物COIF和COIR进行PCR反应；3)将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并测序验证；4)利用MEGA7.0比对获得的序列，同时利用DNAMAN(Version9.0)预测各种对虾代表序列的酶切位点；5)取待放流的长毛明对虾F1代仔虾和亲虾，分别提取基因组DNA；6)利用COIF和COIR，对DNA模板F1～F4，P1～P4，V1，V2，Y1，Y2，V1+Y1(1︰1)，V2+Y2(1︰1)进行PCR扩增，再将所述的PCR扩增产物进行酶切，酶切产物进行电泳鉴定。2.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于在步骤1)中，所述引物为：COIF：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；COIR：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。3.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于在步骤2)中，所述提取长毛明对虾和凡纳滨对虾的基因组DNA，是提取10尾长毛明对虾和10尾凡纳滨对虾的基因组DNA。4.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于在步骤2)中，所述长毛明对虾为Y1～Y10，所述凡纳滨对虾为V1～V10。5.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于在步骤2)中，所述提取的长毛明对虾和凡纳滨对虾的DNA，是采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒DP324，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王攀攀，金烨楠，易啸，王军，苏永全，毛勇，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35