一种检测遗传性心肌病的探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测遗传性心肌病的探针及其应用，通过筛选整合与遗传性心肌病相关的目的基因的外显子区域并针对目的基因的特定区域设计探针，并建立一套能够准确且可靠的检测基因突变的体系，测序深度高，简洁灵敏，组装成试剂盒后用于制备检测遗传性心肌病的试剂和药物，具有广阔的应用前景和市场价值。

A probe for detecting hereditary cardiomyopathy and its application

The invention provides a probe for detecting genetic cardiomyopathy and its application. By screening the exons of the target genes associated with genetic cardiomyopathy and designing a probe for specific regions of the target gene, a system of accurate and reliable detection of gene mutation is established, and the depth of the sequencing is high, Jian Jieling After being assembled into kits, it has broad application prospects and market value for the preparation of reagents and drugs for the detection of inherited cardiomyopathy.

【技术实现步骤摘要】
一种检测遗传性心肌病的探针及其应用
本专利技术涉及基因测序
，尤其涉及一种检测遗传性心肌病的探针及其应用。
技术介绍
高通量测序技术(High-throughputsequencing)又称新一代测序技术("Next-generation"sequencingtechnology)，以能一次并行对几十万到几百万DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。然而全基因组测序的成本和分析的复杂程度还是让科研人员和临床医生倍感困难，目标序列捕获技术的出现，缓解了上述问题，目标序列捕获测序是针对已知的特定基因组区域设计探针捕获后进行测序。目标序列捕获的一种重要的方法是根据核酸分子碱基互补杂交原理发展的。即根据目标基因组序列，设计与之完全互补的探针，将这些探针固定在某些支持物上(用于分离)，然后打断基因组DNA，加上接头(用于测序)后与探针杂交，洗脱未杂交上的DNA，回收目标DNA片段，可以直接建库进行DNA测序。遗传性心肌病主要包括肥厚型心肌病(HCM)、致心律失常性右室心肌病(ARVC/D)、左室心肌致密化不全(LVNC)、心脏离子通道疾病和遗传性心肌淀粉样变。心脏离子通道疾病包括长QT间期综合征(LQTS)、Brugada综合征(BrS)、儿茶酚胺敏感的多形性室速(CPVT)和短QT间期综合征(SQTS)。心肌病患者可因恶性室性心律失常猝死，随着年龄增长，心肌病患者容易进展为心力衰竭，因此心肌病的早期诊断和风险筛查尤为关键。在测序技术飞速发展的同时，精准医学这一概念作为个体化医学的新型表述形式也开始被正式提出并得到重视。精准医疗是以个体化医疗为基础、随着基因组测序技术快速进步以及生物信息与大数据科学的交叉应用而发展起来的新型医学概念与医疗模式。其本质是通过基因组、蛋白质组等组学技术和医学前沿技术，对于大样本人群与特定疾病类型进行生物标记物的分析与鉴定、验证与应用，从而精确寻找到疾病的原因和治疗的靶点，并对一种疾病的不同状态和过程进行精确分类，最终实现对于疾病和特定患者进行个性化精准治疗的目的，提高疾病诊治与预防的效益。精准医学一被提出，即在心血管疾病诊断领域得到应用，通过对遗传性心血管疾病患者进行基因检测，筛查相关的基因突变位点，研究这些位点及其编码的生物分子或蛋白的结构和功能，可以进一步探究发病原因及机制，实现临床上的精确诊断。CN105506115A公开一种通过靶向高通量半导体测序技术检测遗传性心肌病致病基因突变的DNA文库及其应用。具体来说，根据80个遗传性心肌病致病基因，设计引物池，对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据，但该专利技术的高通量测序深度较低，工作量太大，准确度低，费时费力。现有技术使用全外显子组测序的方法进行测序时，人类外显子组较大，测序所需数据量较大，时间较长，测序深度低导致灵敏度低，低频位点和特殊区域的漏检率较高，因此部分基因突变无法有效检出，因此，提供一种基于目标基因捕获的准确度高、简洁高效的检测体系及探针，对于遗传性心肌病的早期诊断和治疗具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种检测遗传性心肌病的探针及其应用，通过筛选整合与遗传性心肌病相关的目的基因的外显子区域并针对目的基因的相关区域设计探针，并建立一套能够准确且可靠的检测基因突变的体系，测序深度高，简洁灵敏，组装成试剂盒后用于制备检测遗传性心肌病的试剂和药物，具有广阔的应用前景和市场价值。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一组探针，包括分别特异性识别多个目的基因的多个探针，且每个探针至少满足下列条件之一：(1)根据目的基因的外显子及外显子内含子交界处进行设计；(2)所述探针的长度为50-200bp，优选为60-150bp；(3)去除含有未知碱基序列的探针；(4)当多个探针之间属于重复序列的比例不小于50％时，去除所述多个探针；(5)保证每个探针5’端碱基为T；(6)含有生物素标记。本专利技术中，所述重复序列的比例例如可以是50％、52％、53％、55％、58％、60％、62％、65％、68％、70％、72％、75％、78％、80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％、98％或100％。根据本专利技术，所述目的基因为选自下列的至少一种：MYBPC3、MYH7、MYH6、TNNT2、TNNI3、GAA、JPH2、CAV3、DES、ACTC1、ACTN2、ACTA1、MYL3、TCAP、TPM1、VCL、TTN、MYLK3、MYPN、ABCC9、LMNA、PKP2、DTNA、DSC2、DSG2、JUP、DSP、RYR2、CASQ2、AKAP9、ANK2、CACNA1C、CACNA2D1、CACNB2、CALM1、KCNE1、KCNE2、KCNE3、KCNQ1、KCNJ2、KCNJ5、KCNJ8、KCNH2、SCN4B、SCN5A、SNTA1、TRPM4、CALM2、BRAF、PTPN11、SOS1、GPD1L、TRDN和SCN1B。为了评估受检者遗传性心肌病的患病风险，辅助医生进行诊断与治疗，本专利技术中，专利技术人充分研究了遗传性心肌病的发病机制与基因组的关系，广泛阅读相关文献，总结筛选与遗传性心肌病相关的目的基因，包括MYBPC3、MYH7、MYH6、TNNT2等导致心肌病的基因，AKAP9、ANK2、CACNA1C等导致离子通道病的基因。本专利技术中，根据设计原则设计了1301条序列，总大小为1.8Mb，所述探针的捕获区域为第一方面所述基因的全部外显子和/或外显子内含子交接区域。上述探针是一段具有生物素标记的DNA序列，可以和目的基因杂交，再通过链霉亲和素标记的磁珠与含有生物素的探针结合，即可完成目标基因区域的靶向富集。第二方面，本专利技术提供一种试剂盒，包含第一方面所述的探针。第三方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的探针和/或如第二方面所述的试剂盒用于检测基因突变。第四方面，本专利技术提供一种检测基因突变的方法，包括如下步骤：(1)提取人基因组DNA并进行片段化后构建基因组文库；(2)根据第一方面所述的基因设计捕获探针并对步骤(1)构建的文库进行杂交捕获；(3)对步骤(2)捕获的目的基因进行高通量测序和生物信息学分析，得到所述基因突变的结果。优选地，提取基因组DNA可任选能够有效提取基因组DNA的试剂盒，本专利技术中使用康为世纪公司的DNA提取试剂盒(AllPureDNA/RNA/ProteinKit)。优选地，构建基因组文库可任选能有效构建基因组文库的试剂盒，本专利技术使用KAPA公司的建库试剂盒(KAPALibraryPrepKit)。优选地，杂交捕获可任选能有效实现杂交捕获的试剂盒，本专利技术中使用罗氏公司的辅助试剂盒(SeqCapEZAccessoryKitv2)。优选地，高通量测序可任选能准确完成高通量测序的平台，本专利技术中选择Illumina公司的NextSeq500测序平台。优选地，步骤(1)所述片段化的长度为150-250bp。其中，步骤(3)所述生物信息学分析包括以下流程：(1’)数据质控；(2’)数据过滤：(3’)比对：(4’)突变识别。优选地，步骤(2’)所述数据过滤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组探针，其特征在于，包括分别特异性识别多个目的基因的多个探针，且每个探针至少满足下列条件之一：(1)根据目的基因的外显子及外显子内含子交界处进行设计；(2)所述探针的长度为50‑200bp，优选为60‑150bp；(3)去除含有未知碱基序列的探针；(4)当多个探针之间属于重复序列的比例不小于50％时，去除所述多个探针；(5)保证每个探针5’端碱基为T；(6)含有生物素标记。

【技术特征摘要】
1.一组探针，其特征在于，包括分别特异性识别多个目的基因的多个探针，且每个探针至少满足下列条件之一：(1)根据目的基因的外显子及外显子内含子交界处进行设计；(2)所述探针的长度为50-200bp，优选为60-150bp；(3)去除含有未知碱基序列的探针；(4)当多个探针之间属于重复序列的比例不小于50％时，去除所述多个探针；(5)保证每个探针5’端碱基为T；(6)含有生物素标记。2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述目的基因为选自下列的至少一种：MYBPC3、MYH7、MYH6、TNNT2、TNNI3、GAA、JPH2、CAV3、DES、ACTC1、ACTN2、ACTA1、MYL3、TCAP、TPM1、VCL、TTN、MYLK3、MYPN、ABCC9、LMNA、PKP2、DTNA、DSC2、DSG2、JUP、DSP、RYR2、CASQ2、AKAP9、ANK2、CACNA1C、CACNA2D1、CACNB2、CALM1、KCNE1、KCNE2、KCNE3、KCNQ1、KCNJ2、KCNJ5、KCNJ8、KCNH2、SCN4B、SCN5A、SNTA1、TRPM4、CALM2、BRAF、PTPN11、SOS1、GPD1L、TRDN或SCN1B。3.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的探针。4.一种如权利要求1或2所述的探针和/或如权利要求4所述的试剂盒用于检测基因突变。5.一种检测基因突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取人基因组DNA并进行片段化后构建基因组文库；(2)根据权利要求1所述的基因设计捕获探针并对步骤(1)构建的文库进行杂交捕获；...

【专利技术属性】
技术研发人员：申童，宋玉凤，周小琳，冯冬，王玲，
申请(专利权)人：北京乐普基因科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11