人工环状RNA的通用表达框架及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种人工环状RNA的通用表达框架及其应用，其具备多microRNA组合抑制能力。该人工环状RNA过表达框架由上游序列、中间序列以及下游序列三部分组成。本发明专利技术设计的人工环状RNA过表达框架能够有效地在细胞中过表达并高效的环化中间序列产生具备多microRNA组合抑制能力的人工环状RNA。本发明专利技术还涉及该人工环状RNA的通用表达框架及携带此框架的真核表达质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒在制备基因治疗药物开发中的应用。 1

【技术实现步骤摘要】
人工环状RNA的通用表达框架及其应用[
]本专利技术涉及人工环状RNA的通用表达框架及其应用。[
技术介绍
]目前，抗肿瘤药物的开发主要集中在小分子化合物(靶向药物)、生物大分子(多肽、蛋白、抗体)以及核酸药物或基因治疗药物等。核酸小分子中microRNA和siRNA具备多靶点调控能力，近二十年的研究证实了大量的microRNA在肿瘤的发生和进展过程中发挥重要的作用。microRNA作为一类内源性核酸小分子，多数的生物学活性和基因调节机制清晰，因此microRNA作为一类重要的基因治疗药物开发靶点引起了研究人员的重视。microRNA是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。目前的研究表明microRNA通过复杂而精细的基因调控网络参与肿瘤的发生、发展以及耐药和复发等多个病理进程。随着RNA分子输送技术的发展，以及microRNA本身的小分子单链核酸结构所具备的低免疫原性的优势，使得基于microRNA的生物药物开发更加容易实现。然而，microRNA本身的特征以及基于microRNA的药物开发仍存的诸多技术难点等因素限制了其开发的效率。首先，核酸药物在体内发挥作用的最大障碍在于核酸酶的降解作用及内吞过程中药物分子从内吞体的逃逸。虽然目前核酸分子的化学修饰技术以及核酸药物的递送技术有了很大的提高，可以提高核酸药物分子的稳定性和药物分子的输送效率，但是microRNA分子本身的结构局限决定了其在体内的半衰期难以很好的满足临床应用的要求；另外，目前常用的核酸药物递送系统本身潜在的免疫刺激作用以及对病区的靶向特异性缺失等特点也限制了核酸药物的开发效率；其次，虽然近二十年的研究证实了上百种microRNA参与了肿瘤的病理过程，但是由于肿瘤调控机制的复杂性，肿瘤的发生和进展是多基因网络调控的结果，而基于单个microRNA的核酸分子往往亦很难有效控制肿瘤在体内的恶性进展，目前仅有EnGenelC开发的MesomiR-1(miR-16mimic)和MirnaTherapeutics开发的MRX34(miR-34mimic)两种核酸小分子药物成功进入了抗肿瘤的临床1期实验也应证了基于单个microRNA的核酸药物开发的局限性。综上所述，microRNA作为抗肿瘤药物开发靶点，其本身具备多靶点调节能力和内源性的天然优势，然而亦存在半衰期短、递送系统限制以及对肿瘤调控网络的调控能力不足等条件限制。那么如何取长补短，充分利用microRNA的抗肿瘤潜力？近十年随着高通量测序能力的长足发展，另一类具备多靶点调控能力的内源性核酸分子环状RNA引起了研究人员的重视。环状RNA(circularRNA，circRNA)是区别于传统线性RNA的一类新型RNA，其不具有传统线性RNA中的5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴，而以闭合环状结构存在。研究认为，circRNA可以作为“sponge”海绵吸附细胞内的microRNA，阻断microRNA对其靶基因的抑制作用，这一特征使得circRNA作为抗肿瘤药物开发靶点具备与microRNA类似的价值。另外，因其具有独特的闭环结构，对核酸酶不敏感，因此与常规线性RNA、microRNA以及siRNA相比，circRNA在生物体中具有更强的稳定性，这一特征可能很好的弥补microRNA体内半衰期端的劣势。此外，对于circRNA在肿瘤中作用和发挥作用的机制研究表明，circRNA可以通过“sponge”的作用模式同时竞争性吸附多种microRNA，阻断microRNA对于其靶基因表达的负调控，从而参与恶性肿瘤的进展，这一特征能够很好的弥补单一microRNA网络调控能力的不足。上述环状RNA闭环结构带来的稳定性优势以及其对于microRNA的调控活性，使得circRNA作为一种基因调控工具在抗肿瘤基因治疗药物开发的研究中具有极大的潜在价值。然而，基于circRNA药物的开发首先必须要解决三个基础的技术问题：其一，目前circRNA的化学合成技术难以实现。因此，生物合成circRNA成为目前circRNA制备的首选方法，而circRNA在细胞内的大量表达和高效的成环效率是亟待解决的关键技术。其二，内源性circRNA中除了作为“sponge”海绵竞争性吸附抑制microRNA的靶点序列外还存在大量生物活性未知的序列，基于内源性circRNA进行基因治疗药物开发尚存在未知风险，因此，利用内源性circRNA进行抗肿瘤药物开发需要研究人员解析清楚circRNA结构中功能位置的“冗余”序列，或者剔除“冗余”序列利用有效的靶点序列。其三，虽然研究证实circRNA结构中存在多个靶点序列，具备同时吸附调控多个microRNA的能力，然而某个单一的内源性circRNA对于肿瘤microRNA的网络调控能力还是不足，需要研究人员开发出一种相比于内源性circRNA具备更多或更强的靶点吸附调控能力的circRNA。综上所述，模拟内源性circRNA利用自身反向互补序列来吸附抑制内源microRNA的生物学活性，利用多靶点结合序列组合的方式设计人工circRNA，以此人工circRNA来实现对多个microRNA的网络调控，同时规避内源性circRNA中生物活性未知的冗余序列带来的潜在生物风险是基于circRNA的基因治疗药物开发的另一关键技术和研发方向。[
技术实现思路
]本专利技术的目的在于提供一种具备多microRNA组合抑制能力的人工环状RNA的通用表达框架，以及利用真核表达质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等不同表达系统表达的人工环状RNA的通用表达框架及其应用。为实现上述目的，本专利技术包括一种式I序列的人工环状RNA的通用表达框架，其中，US为上游序列，碱基序列如SEQIDNO.1所示，DS为下游序列，碱基序列如SEQIDNO.2所示，N为microRNA吸附位点的序列，LS为连接序列，n个相同或不同的microRNA吸附位点序列通过连接序列连接并隔离，避免相邻两个吸附位点之间的干扰，n为自然数。上述人工环状RNA的通用表达框架还具有如下优化方案：连接序列主要的作用是将相邻的两个吸附点位进行连接并隔离，避免相邻两个吸附位点之间的干扰，诸如可以采用ACACAC。microRNA吸附位点的序列由待吸附microRNA成熟体的反向互补DNA序列或该反向互补DNA序列的优化序列决定。microRNA吸附位点序列的碱基数为10-30bp，或进一步的为18-30bp。而其中的n为自然数，最佳范围为5≤n≤50。本专利技术还包括另一种人工环状RNA的通用表达框架，碱基序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术还包括又一种人工环状RNA的通用表达框架，碱基序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术还包括一种上述人工环状RNA的通用表达框架的表达方法，利用真核质粒表达系统、慢病毒表达系统、腺病毒表达系统、腺相关病毒表达系统或逆转录表达系统表达。本专利技术还包括一种人工环状RNA，由上述人工环状RNA的通用表达框架利用真核质粒表达系统、慢病毒表达系统、腺病毒表达系统、腺相关病毒表达系统或逆转录表达系统表达。上述人工环状RNA的通用表达框架可以应用到制备基因治疗药物中。与现有技术相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种式I序列的人工环状RNA的通用表达框架，

【技术特征摘要】
1.一种式I序列的人工环状RNA的通用表达框架，其中，US为上游序列，碱基序列如SEQIDNO.1所示，DS为下游序列，碱基序列如SEQIDNO.2所示，N为microRNA吸附位点的序列，LS为连接序列，n个相同或不同的microRNA吸附位点序列通过连接序列连接并隔离，避免相邻两个吸附位点之间的干扰，n为自然数。2.如权利要求1所述的人工环状RNA的通用表达框架，其特征在于所述的连接序列为ACACAC。3.如权利要求1所述的人工环状RNA的通用表达框架，其特征在于microRNA吸附位点的序列由待吸附microRNA成熟体的反向互补DNA序列或该反向互补DNA序列的优化序列决定。4.如权利要求1所述的人工环状RNA的通用表达框架，其特征在于microRNA吸附位点序列的碱基数...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗卫峰，张腾，谭圆圆，张立红，王秀秀，
申请(专利权)人：上海锐赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31