一种可促进血管快速生成的骨组织工程支架制造技术

本发明专利技术为一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架及其制备。本发明专利技术中，采用超临界流体强制分散溶液技术制备载有PDGF(血小板衍生生长因子)的PLLA(左旋聚乳酸)微球，再利用超临界二氧化碳发泡技术将微球、VEGF(血管内皮细胞生长因子)和FGF‑2(碱性成纤维细胞生长因子)三者共同载入PLGA(聚乳酸‑羟基乙醇酸)多孔支架中，最后在支架上种植血管内皮细胞，构建可协同调控血管生成的复合支架。本发明专利技术中，种植的血管内皮细胞可分化为新血管，其分泌的细胞外基质可提高相关细胞的粘附，三种血管诱导因子的次第释放可诱导血管的生长，三者协同作用可促进骨修复过程中血管的快速生成。本发明专利技术制备操作简单，所制得的复合支架具有良好的生物相容性及功能性，在组织工程修复体中具有应用前景。 1

A scaffold for bone tissue engineering to promote rapid angiogenesis

The invention is a composite scaffold which can promote the rapid generation of blood vessels in bone tissue engineering and its preparation. In the present invention, PLLA (L-polylactic acid) microspheres carrying PDGF (platelet-derived growth factor) are prepared by supercritical fluid forced dispersion solution technology, and then the microspheres, VEGF (vascular endothelial growth factor) and FGF 2 (basic fibroblast growth factor) are co loaded with PLGA by supercritical carbon dioxide foaming technology. In the porous scaffold of lactic acid hydroxyglycolic acid, finally, the vascular endothelial cells were implanted on the scaffold to construct a composite scaffold which could co regulate angiogenesis. In the present invention, the cultured vascular endothelial cells can differentiate into new blood vessels, and the extracellular matrix secreted by them can improve the adhesion of the related cells. The secondary release of three vascular inducer can induce the growth of blood vessels. The three synergies can promote the rapid growth of blood vessels in the process of bone repair. The preparation of the composite scaffold has good biocompatibility and functionality, and has a good application prospect in tissue engineering prosthesis. One

【技术实现步骤摘要】
一种可促进血管快速生成的骨组织工程支架
本专利技术为一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架及其制备，属于药物剂型改变及其制备方法
具体地说，是利用超临界流体技术将微球和支架结合起来制备血管组织工程支架的新方法，特别涉及超临界流体强制分散溶液技术和超临界发泡技术对载药微球和复合支架的绿色可控制备过程，及复合支架中PDGF、FGF-2和VEGF三种血管诱导因子的次第可控释放。
技术介绍
血管不仅是氧气、各种营养成分及代谢废物的运输通道，而且是参与组织修复的细胞信号分子通过的重要途径，从整体上维持骨组织修复的代谢微环境。因此，迅速有效的血管重建是骨组织再生的前提和保障，也是长期制约组织工程骨发展和临床应用的关键问题。在血管生成的过程中，各种生长因子对局部组织、细胞的调控作用至关重要，其应用被认为是解决组织工程血管化最直接有效的途径之一。各种血管诱导因子的靶向细胞和诱导机理均不同，它们分别作用于血管生成的不同时期，且各种因子之间还存在着相互协同调控的作用。其中，VEGF、FGF和PDGF三种生长因子的作用至关重要。VEGF是已知的诱导血管生成作用最显著的生长因子，通过与内皮细胞膜受体的特异性结合促进内皮细胞的增殖、分化、迁移，还能够增强血管通透性，抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，促进血浆物质向平滑肌细胞构成的亚内皮层聚集。FGF-2能够促进多种细胞的增殖和分化，同时调节细胞代谢，包括纤溶酶原激活物和胶原酶的分泌，调节其他生长因子的表达与合成。PDGF是一种由血小板产生的糖蛋白，作为一种有丝分裂原和趋化因子，能同时促进成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的分裂和生长。虽然这些生长因子对血管生成的诱导作用都已经得到证实，但是单一的生长因子不能实现真正意义上的组织再生，因为组织修复再生是一个多因子协同调控的结果，如何实现多种生长因子对血管生成的协同调控是关键。生长因子对血管生成的协同调控与其种类、组合、剂量、作用时间和方式等多种因素有关。本课题组的前期工作研究了VEGF、FGF-2和PDGF对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)血管分化和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)中血管生成的剂量依赖性、时间依赖性及各个因子间的协同效应。结果证明，VEGF和FGF-2对血管生成的最佳诱导时间是血管生成的前期，即前7天；而PDGF对血管生成的最佳诱导时间是血管生成的中后期，即7-21天。三种因子联合应用对血管生成和成骨均有显著的协同诱导效应。然而，直接使用生长因子存在半衰期短、容易失活、缺乏稳定性和组织选择性等问题，而且无法按照组织生长不同阶段的需要分段释放、协同调控。因此，需要根据不同因子的诱导特性和机理构建一种具有多种生长因子次第释放特性的载体系统，使其模拟血管形成与再生的生理过程，适时适量地释放不同的生长因子到需要的组织和细胞。但是，目前尚未见报道此类载体系统。本研究基于不同生长因子协同调控血管再生机理，结合微球和支架缓释系统各自的特点，制备一种释放初期以VEGF和FGF-2为主，中后期以PDGF为主的组织工程，使其有效促进骨组织工程中血管快速生成。在生长因子载体系统的构建方法上，传统的方法如乳化法、喷雾干燥法、熔融法、盐析法等，常伴有高温高压、反应条件苛刻等问题，对蛋白类药物的稳定性和生物活性产生较大的影响。因此，为了最大化保持蛋白活性，采用一种温和工艺条件方法来制备载生长因子的聚合物载体是必要的。超临界流体技术智能性地满足这一要求。超临界二氧化碳流体技术因其无毒无污染、成本较低、反应条件温和、产品无有机溶剂残留、绿色环保等特点提供了相对传统方法更加洁净有效的技术优势，该方法能够最大化地保持生长因子活性，在蛋白类药物载体的制备方面更显独特优势。但是目前，将超临界流体技术用于复合微球和支架的多种生长因子载体系统的制备还尚未见报道。专利技术的目的根据不同血管诱导因子的诱导机理和作用特性，利用超临界流体技术将微球和支架进行复合制备一种模拟生理修复状况模式释放不同生长因子的聚合物载体系统，快速有效地促进组织工程骨中血管的生成。专利技术的基本构思生长因子缓释系统不能仅仅局限释放单一生长因子，而应该在一种类似生理修复状况模式下以最佳的比例释放多种生长因子到需要的靶向细胞。本专利技术根据生长因子协同调控血管生成的最佳诱导模式，采用超临界二氧化碳强制分散技术将PDGF载入聚乳酸(PLLA)微球中，再采用超临界二氧化碳发泡技术将PDGF-PLLA微球、VEGF和FGF-2冻干粉载入复合支架中构建多生长因子缓释系统，使其按照设计的释放特性和剂量分阶段次第释放多种生长因子，以满足血管再生生理状况下的时间和空间上的生长因子需要，从而迅速有效地实现组织工程骨的血管化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据不同因子对血管生成的诱导机理和协同作用制备一种模拟生理修复状况模释放多种生长因子的复合支架。采用超临界二氧化碳强制分散技术将PDGF载入聚乳酸(PLLA)微球中，再采用超临界二氧化碳发泡技术将PDGF-PLLA微球、VEGF和FGF-2冻干粉载入复合支架中构建多生长因子缓释系统，使其按照设计的释放特性和剂量分阶段次第释放多种生长因子。从而迅速有效地实现组织工程骨的血管化，为组织工程骨的进一步应用提供了技术保障。本专利技术制备的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架所采用的工艺步骤如下：(1)PDGF-PLLA微球的制备：将PDGF溶于二甲亚砜，PLLA溶于二氯甲烷中。当两种溶液都完全溶解后，将两者混合均匀。混合后的溶液经过高效液相色谱(HPLC)泵泵入高压沉积反应釜中，经历超临界流体强制分散溶液技术(SEDS)过程。沉淀析出的微球收集后储存于-20℃待用。(2)复合支架的制备：将PLGA与羟基磷灰石(HA)按一定的比例研磨，加入一定量的PDGF-PLLA载药微球，以及FGF-2和VEGF冻干粉(FGF-2和VEGF冻干粉先用10000r/min或12000r/min，离心30s，重悬于pH7.6，5mmol/LTris至0.1g/L，加入事先混合好的PLGA、HA和PDGF-PLLA微球粉末中轻轻混匀后冻干)，将混合粉末放入直径为5mm的圆柱形模具中室温下进行压制得到小圆片，取出。然后置于聚四氟乙烯圆柱体模具内并将模具放入超临界CO2不锈钢反应釜中，采用超临界CO2发泡技术制备多孔复合支架。(2)血管内皮细胞的种植：将直径为5mm的复合支架放置于24孔板内，紫外线照射0.5h。再用75％酒精消毒，PBS浸泡清洗3次。将无菌的复合支架放置在DMEM培养液中孵育过夜。第4代血管内皮细胞经过培养消化后，制备成密度为1×105/ml的细胞悬液，分别种植于已准备好的支架材料上，37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养24h。本专利技术原创性和显著的技术进步在于：基于一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备，一方面，利用超临界流体强制分散溶液技术制备载PDGF的PLLA微球，并采用超临界二氧化碳发泡技术将微球和VEGF、FGF-2共同载入支架中制备复合支架。不但能够调控复合支架的性能，还有效保障了生长因子的生物活性，并可用于其他蛋白类大分子药物载体的制备。另一方面，本专利技术制备的复合支架结合了微球和支架的优势，模拟生理修复模式释放PDGF、FGF-2和VEGF，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法，其特征在于，所述

【技术特征摘要】
1.一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：(1)PDGF-PLLA微球的制备：将PDGF溶于二甲亚砜，PLLA溶于二氯甲烷中。当两种溶液都完全溶解后，将两者混合均匀。混合后的溶液经过高效液相色谱(HPLC)泵泵入高压沉积反应釜中，经历超临界流体强制分散溶液技术(SEDS)过程。沉淀析出的微球收集后储存于-20℃待用。(2)复合支架的制备：将羟基磷灰石(HA)与PLGA按1:4-1:2例研磨，加入一定量的PDGF-PLLA载药微球，以及FGF-2和VEGF冻干粉(FGF-2和VEGF冻干粉先用10000r/min或12000r/min，离心30s，重悬于pH7.6，5mmol/LTris至0.1g/L，加入事先混合好的PLGA、HA和PDGF-PLLA微球粉末中轻轻混匀后冻干)，将混合粉末放入直径为1-8mm的圆柱形模具中室温下进行压制得到小圆片，取出。然后置于聚四氟乙烯圆柱体模具内并将模具放入超临界CO2不锈钢反应釜中，采用超临界CO2发泡技术制备多孔复合支架。(3)血管内皮细胞的种植：将复合支架放置于24孔板内，紫外线照射0.5h。再用75％酒精消毒，PBS浸泡清洗3次。将无菌的复合支架放置在DMEM培养液中孵育过夜。第4代血管内皮细胞经过培养消化后，制备成密度为1×105/ml的细胞悬液，分别种植于已准备好的支架材料上，37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养24h。2.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法，其特征在于，步骤1中，采用SEDS制备PDGF-PLLA微球时，通过双通道喷嘴分别将试验溶液和超临界CO2(SCCO2)喷入高压反应釜中。当溶液接触到SCCO2后，溶剂被SCCO2萃取，使得试验溶液变成溶质的过饱和溶液，溶质从溶液中已微球的形式结晶析出。结束泵样后，维持压力和温度不变，继续通入CO2淋洗30-60分钟以去除残留有机溶剂。3.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法，其特征在于，步骤1中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：白燕，丁庆，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50