一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法，首先对植物幼嫩组织进行前处理，酶解细胞壁后过滤，利用DAPI染色在流式细胞仪上分选收集细胞核，过滤细胞核，有效的降低了细胞壁及亚细胞器对实验数据的干扰。进行Tn5转座酶切反应与纯化，qPCR确定建库所需循环数，最后对得到的单个文库进行等摩尔混合，采用优化过的两轮磁珠比例分选得到高质量的上机文库，为广大科研人员研究植物幼嫩组织易接近转座酶核染色质高通量测序提供重要的实验方法参考。

A database method for chromatin analysis of plant transposable enzyme accessibility

The invention discloses a method of building a library suitable for chromatin analysis of plant transposable enzymes. First, pretreatment of plant young tissues, filtration of cell wall after enzymatic hydrolysis, and DAPI staining on flow cytometry to collect the nucleus and filter the nucleus, effectively reduce the number of cell walls and the number of subcellular organelles. According to the interference. Tn5 transposing enzyme digestion and purification, qPCR determine the number of cycles required for the establishment of the library, and finally the obtained single library is mixed, and the optimized two rounds of magnetic beads are selected to get the high quality library, which provides the scientific research personnel to study the high flux sequencing of the plant young tissues easily connected with the near transposable chromatin chromatin Important experimental methods are referenced.

【技术实现步骤摘要】
一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法
本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法。
技术介绍
ATAC-seq是通过使用高通量测序对转座酶可接近性核染色质区域进行分析(AssayforTransposase-AccessibleChromatinwithhighthroughputsequencing)的一种创新表观遗传学研究技术。该技术通过转座酶对某种特定时空下开放的核染色质区域进行切割，进而获得在该特定时空下基因组中所有活跃转录的调控序列。真核细胞将基因组DNA与组蛋白通过不同层次的折叠组装成染色质，这些精密组装信息在基因转录调控中起决定性作用。染色质区域的可接近性是特异性反式作用因子和顺式调控元件相互作用的前提，基因表达的异常或者染色质调控因子的改变都将对细胞的命运产生深远的影响，进而导致各种疾病的发生与发展。目前该技术已被广泛应用于转录调控序列的鉴定。ATAC-seq技术可运用于所有真核细胞重编程的研究，在医学领域是重大疾病发病机制、药物作用机制、新药研发和生物标志物功能等研究的新一代有利工具。染色质结构在促进基因表达控制方面起着关键作用。转录因子结合的顺式元件通常与染色质区域的可接近性相关。因此，在植物基因组中识别这些可接近性区域，将有利于提高对转录因子结合、染色质状态和基因表达调控三者之间关系的理解。ATAC-seq现在通常被用于系统地鉴定动物基因组中的顺式调控区域和DNA足迹，然而，这种方法对植物物种的应用是一个挑战。在植物中，细胞壁和细胞器的存在、稳定细胞系的缺乏阻止了该技术在植物中的应用。植物染色质提取物中常含有线粒体和叶绿体等细胞器基因组，由于细胞器基因组也可以被Tn5转座酶接近并切割，因此降低了用于酶切植物基因组的Tn5转座酶活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法，降低了植物叶片细胞壁及亚细胞器中基因组带来的实验干扰，采用优化过的实验条件，通过两轮磁珠分选，保留最佳上机测序文库大小，从而得到高质量上机数据，为植物叶片易接近转座酶核染色质的研究提供重要的实验方法参考。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法，包括以下步骤：S1：植物组织(幼嫩组织)样本经酶解液TS2和裂解液TS1处理后，得到细胞核悬浮液A；S2：对细胞核悬浮液A中的细胞核进行染色(DAPI染色)、分选，得到细胞核B；S3：对细胞核B进行转座反应与纯化，得到转座产物C；S4：对转座产物C进行PCR扩增，得到扩增产物D；转座产物C的取样量为1～100ng，优选取样量为40～60ng；S5：取部分扩增产物D进行qPCR以确定额外所需PCR循环数，根据确定的额外所需PCR循环数对剩余扩增产物D继续扩增，得到扩增产物E；S6：纯化扩增产物E得到单一文库，单一文库进行片段分选，得到上机文库。作为优选，S1具体步骤如下：取200～300mg植物组织，用刀片在放置于冰上的培养皿中将组织切碎成匀浆状，加入2.5～3.0mL酶解液TS2酶解4h去除细胞壁；4℃、300～400rpm离心10min后弃上清；加入2.5～3.0mL预冷的裂解液TS1，转入离心管中并置于混匀器上100～150rpm振荡5min，得到完全裂解后的混合液；将混合液过滤两次，所得滤液分布于不同密度的分层液中，1000～1300rpm离心20～25min，收集分离的细胞核，加入600μL裂解液TS1，得到细胞核悬浮液A。分层液配置方法如下：取9倍体积的分层原液，加入1倍体积的10×磷酸缓冲液，得到100％的分层液，取2.5mL100％分层液，加入2.5mL1×磷酸缓冲液，得到50％分层液，其它密度的分层液依次使用100％分层液和1×磷酸缓冲液配制；10×磷酸缓冲液的配制方法如下：1.37MNaCl，20.7mMKCl，100mMNa2HPO4·12H2O，17.6mMKH2PO4；1×磷酸缓冲液的配制方法如下：9倍体积的超纯水加入1倍体积的10×磷酸缓冲液，混合均匀。作为优选，S2具体步骤如下：将细胞核悬浮液A使用40μm无菌过滤器过滤，收集滤液进行细胞核染色并根据细胞核大小进行分选，分选的细胞核使用预先装入600μL裂解液TS1的离心管进行收集；显微镜下观察分选得到的细胞核质量后，将收集到的细胞核4℃、1000～1300rpm离心15min，弃上清，加入600μL洗涤缓冲液洗涤细胞核，1000～1300rpm离心10min后弃上清得到细胞核B。作为优选，所述洗涤缓冲液组分构成如下：10mMTris-HClpH8.0，5mMMgCl2。作为优选，S3具体步骤如下：取细胞核B立即进行转座反应，细胞核B加入Tn5转座酶后，37℃水浴反应30～70min；对水浴后的转座产物进行纯化，得到转座产物C。此步骤中细胞核数量及酶切时间是影响文库质量的关键因素，根据实验结果得出，40000个细胞核，酶切时间50min，能得到较好的实验结果，细胞核过多，酶切时间太短，会导致染色质未充分酶切，片段较大，影响上机成簇；细胞核太少，酶切时间长，会导致过度酶切，酶切异染色质区域。作为优选，所述酶解液TS2组分构成如下：0.5％～1.5％纤维素酶，0.3％～0.6％果胶酶，0.3％～0.6％半纤维素酶，0.45～0.55M甘露醇，20mMKCl，10mM、pH5.7的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，10mMCaCl2，0.1％牛血清白蛋白。该酶解液TS2的制备方法如下：混合纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、甘露醇、KCl、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物并置于56℃水浴10min，冷却至室温后，加入CaCl2和牛血清白蛋白，并用0.45μm滤膜过滤到培养皿中。作为优选，所述裂解液TS1组分构成如下：20mMTris-HClpH8.0，75mMKCl，15mMNaCl，0.5mM精胺，10mMβ-巯基乙醇，2％PVP，0.3％TritonX-100。作为优选，S5中确定额外所需PCR循环数，其计算方式如下：根据荧光定量PCR曲线图，取最大荧光值1/4时对应的循环数为额外所需的循环数。该循环数的数值为0～7，优选4～6个循环。作为优选，S6具体步骤如下：将扩增产物E分别纯化后，得到单一文库，测定单一文库的浓度，根据浓度将多个单一文库等摩尔浓度混合成混合文库，混合文库使用两轮DNA磁珠进行片段分选，保留200～1000bp(优选200～700bp)的DNA片段得到分选后文库，使用核酸分析仪器进行文库质量检测，检测合格后得到上机文库。作为优选，混合文库使用两轮DNA磁珠进行片段分选，第一轮磁珠的体积比例为0.4×～0.9×，第二轮磁珠的体积比例为0.5×～1.0×。磁珠体积比例×的含义为：DNA磁珠与扩增产物E的体积比。优选的分选条件为第一轮磁珠体积比例为0.5×，第二轮磁珠体积比例为0.7×。本专利技术的有益效果是：本专利技术首先对植物幼嫩组织进行前处理，酶解细胞壁后过滤，利用DAPI染色在流式细胞仪上分选收集细胞核，过滤细胞核，有效的降低了细胞壁及亚细胞器对实验数据的干扰。进行Tn5转座酶切反应与纯化，qPCR确定建库所需循环数，最后对得到的单个文本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：植物组织样本经酶解液TS2和裂解液TS1处理后，得到细胞核悬浮液A；S2：对细胞核悬浮液A中的细胞核进行染色、分选，得到细胞核B；S3：对细胞核B进行转座反应与纯化，得到转座产物C；S4：对转座产物C进行PCR扩增，得到扩增产物D；S5：取部分扩增产物D进行qPCR以确定额外所需PCR循环数，根据确定的额外所需PCR循环数对剩余扩增产物D继续扩增，得到扩增产物E；S6：纯化扩增产物E得到单一文库，单一文库进行片段分选，得到上机文库。

【技术特征摘要】
1.一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：植物组织样本经酶解液TS2和裂解液TS1处理后，得到细胞核悬浮液A；S2：对细胞核悬浮液A中的细胞核进行染色、分选，得到细胞核B；S3：对细胞核B进行转座反应与纯化，得到转座产物C；S4：对转座产物C进行PCR扩增，得到扩增产物D；S5：取部分扩增产物D进行qPCR以确定额外所需PCR循环数，根据确定的额外所需PCR循环数对剩余扩增产物D继续扩增，得到扩增产物E；S6：纯化扩增产物E得到单一文库，单一文库进行片段分选，得到上机文库。2.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，S1具体步骤如下：取200～300mg植物组织，用刀片在放置于冰上的培养皿中将组织切碎成匀浆状，加入2.5～3.0mL酶解液TS2酶解4h去除细胞壁；4℃、300～400rpm离心10min后弃上清；加入2.5～3.0mL预冷的裂解液TS1，转入离心管中并置于混匀器上100～150rpm振荡5min，得到完全裂解后的混合液；将混合液过滤两次，所得滤液分布于不同密度的分层液中，1000～1300rpm离心20～25min，收集分离的细胞核，加入600μL裂解液TS1，得到细胞核悬浮液A。3.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，S2具体步骤如下：将细胞核悬浮液A使用40μm无菌过滤器过滤，收集滤液进行细胞核染色并根据细胞核大小进行分选，分选的细胞核使用预先装入600μL裂解液TS1的离心管进行收集；显微镜下观察分选得到的细胞核质量后，将收集到的细胞核4℃、1000～1300rpm离心15min，弃上清，加入600μL洗涤缓冲液洗涤细胞核，1000～1300rpm离心10min后弃上清得到细胞核B。4.根据权利要求1所述的建...

【专利技术属性】
技术研发人员：童云广，王华印，徐鹭芹，赵楠，胡浅浅，
申请(专利权)人：奥明杭州基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33