一株石油芳香烃降解酵母菌及其应用制造技术

本发明专利技术公布了一种石油芳香烃降解酵母菌G‑94，其分类学命名为热带假丝酵母菌

A strain of petroleum aromatics degrading yeast and its application

The invention discloses an oil aromatic hydrocarbon degrading yeast G, 94, and its taxonomy is named Candida tropicalis.

【技术实现步骤摘要】
一株石油芳香烃降解酵母菌及其应用
本专利技术涉及一株石油芳香烃降解酵母菌及其应用，属微生物降解石油污染物

技术介绍
在原油的开采、运输、储存、炼制和使用过程中，大量原油及其衍生产品不可避免地进入环境中，对土壤和水体造成严重污染。原油的化学组成复杂，包括烷烃、环烷烃、芳香烃等多种有毒物质，其中一些芳香烃化合物具有潜在或被证实的致癌变、致突变和致畸变作用，并能通过食物链在动植物及人体内富集，对生态环境和人类健康造成巨大威胁。微生物降解已被证实是一种非常有效的石油污染清除技术，其具有经济高效、环境友好、不产生二次污染等优点，其技术的关键是筛选出高效降解目标污染物的微生物，现有的降解微生物由于对生长环境和降解环境耐受性差导致对原油的降解能力存在较大差异，因此，有必要筛选出具有对生长环境要求低、生长速度快、降解速度快的原油降解菌，研究其降解特性，为原油污染环境的生物治理提供菌株和基因材料。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一株能够高效降解石油芳香烃的酵母菌株，应用于石油污染土壤或石油污染水体的生物修复，该菌株在28℃、pH8.0、油浓度0.3%、盐浓度0.5%、接种量4%、N源(NH4)2SO4、P源K2HPO4的环境下培养30d对石油芳香烃具有67.32%的降解率。本专利技术的技术方案是：一株石油芳香烃降解酵母菌，其分类学命名为热带假丝酵母菌CandidaTropicalis.G-94，已于2017年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：M2017402。所述的热带假丝酵母菌G-94菌落特征和生理生化特征为：椭球形，直径为15.50mm，菌落呈乳白色，边缘整齐，中部凸起，表面光滑；过氧化氢酶试验、甲基红试验、产氨试验和产硫化氢试验、V-P试验和苯丙氨酸脱氢酶试验阳性，明胶液化试验、吲哚试验、柠檬酸盐试验、淀粉水解试验、油脂水解试验、硝酸盐还原试验阴性。所述的热带假丝酵母菌G-94通过ITSrRNA基因序列比对结果分析，与热带假丝酵母菌CandidaTropicalis的ITSrRNA基因序列的同源性最高，相似性为99%。所述的热带假丝酵母菌G-94在降解石油芳香烃污染的土壤或石油芳香烃污染的水体中的应用。所述的热带假丝酵母菌G-94对石油芳香烃的最适宜降解条件为：温度为28℃，pH值为8.0，油浓度为0.3%，接种量为4%，N源为(NH4)2SO4，P源为K2HPO4。所述的热带假丝酵母菌G-94对石油芳香烃的降解率达67.32%。所述的热带假丝酵母菌G-94能以石油作为唯一碳源的无机盐培养基上进行生长，热带假丝酵母菌G-94的最适宜生长条件为：温度为25-45℃，pH为7.5-9.5，盐浓度为0.2%-0.6%。本专利技术的有益效果在于：本专利技术所提供的菌株对石油芳香烃污染物具有高效快速地降解能力，该菌株能够以石油作为唯一碳源，对石油芳香烃的降解率达到67.32%，具有广泛的温度、pH值和盐度适应能力，在消除石油污染物方面具有较好的应用前景和经济价值。附图说明图1为本专利技术热带假丝酵母菌G-94的菌落形态和菌体照片；图2为本专利技术热带假丝酵母菌G-94的系统发育树图；图3为本专利技术热带假丝酵母菌G-94以石油为唯一碳源条件下的生长曲线图；图4为本专利技术热带假丝酵母菌G-94不同温度条件下的石油芳香烃的降解曲线图；图5为本专利技术热带假丝酵母菌G-94不同pH条件下的石油芳香烃降解曲线图；图6为本专利技术热带假丝酵母菌G-94不同油浓度条件下的石油芳香烃降解曲线图；图7为本专利技术热带假丝酵母菌G-94不同盐度条件下的石油芳香烃降解曲线图；图8为本专利技术热带假丝酵母菌G-94不同接种量条件下的石油芳香烃降解曲线图；图9为本专利技术热带假丝酵母菌G-94不同N源条件下的石油芳香烃降解曲线图；图10为本专利技术热带假丝酵母菌G-94不同P源条件下的石油芳香烃降解曲线图。具体实施方式本专利技术通过以下方法来筛选、确认菌株种类，同时提供该菌株各项优异性能，具体内容如下：1材料与方法1.1石油污染土壤样品采集石油污染土壤样品来源于潜江广华油田采油区石油污染土壤，经测定污染土壤的含水率为35%，pH值为8.0。1.2培养基1.2.1无机盐培养基NaNO31.5g、(NH4)2SO41.5g、K2HPO41.0g、MgSO4·7H2O0.5g、KCl0.5g、NaCl5.0g、FeSO4·7H2O0.01g、CaCl20.02g、蒸馏水1000mL、pH7.0、石油0.5%，每支三角瓶装100mL。1.2.2真菌选择性培养基（马丁-孟加拉红培养基）葡萄糖10g，蛋白胨5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，琼脂20g，孟加拉红33.4mg，庆大霉素2mL，自来水1000mL。1.2.3马铃薯蔗糖固体培养基马铃薯（去皮）200g、蔗糖20g、琼脂粉20g自来水1000mL、pH自然。1.2.4马铃薯蔗糖液体培养基马铃薯（去皮）200g、蔗糖20g、自来水1000mL、pH自然。1.3降解菌的分离和形态观察菌株的分离操作步骤如下：（1）称取5g新鲜的石油污染土壤样品，加入至100mL的无机盐液体培养基中，置于恒温摇床中35℃、150r/min震荡培养5d，然后将菌液转接到新鲜的无机盐培养基中，菌液：新鲜的无机盐培养基的体积比为1:20，重新置于恒温摇床中35℃、150r/min震荡连续培养3代（共15d），获得混合菌群液。（2）将上述制得的混合菌群液100μL均匀涂布于真菌选择性培养平板上，置于培养箱中28℃恒温培养48h。（3）挑取生长速度快的单独菌落，接种于真菌选择性培养基上进行平板划线纯化，直至平板上所有菌落形态一致，即为单一菌株。纯化后的菌株接种于马铃薯蔗糖斜面固体培养基中，采用20%灭菌甘油冻管法保存于-80℃的冰箱中。以上实验均在无菌操作条件下进行。1.4菌株的形态学和分子生物学鉴定1.4.1使用正置显微镜（OLYMPUS）对分离菌株进行形态学观察。在观察前，对菌株G-94进行染色：（1）涂片：取干净的载玻片一块，在载玻片上滴一滴水，按照无菌操作法取菌涂片，将G-94做成浓菌悬液。再取干净的载玻片一块，滴一滴水，将浓菌液取1～2环涂上去制成薄涂面；（2）晾干：让薄涂片自然晾干；（3）固定：手执载玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定；（3）结晶紫染色：将固定过的涂片放在废弃缸上的搁架上。加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1min；（4）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗；（5）脱色：将玻片倾斜，连续点滴95%乙醇通过涂面脱色20～25s至流出液无色，立即水洗；（6）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干；（7）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察。1.4.2菌株的分子生物学鉴定（1）DNA的提取将上述分离纯化后的菌株接种于马铃薯蔗糖液体培养基中，在恒温振荡培养箱中28℃、150r/min振荡培养48h，按照上海生工生物公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒的离心法步骤对筛选出的菌株G-94进行总DNA的提取，然后将提取出的DNA置于-20℃温度下保存并尽快进行PCR扩增。（2）PCR扩增模板是提取的该菌株G-94的总DNA，然后利用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株石油芳香烃降解酵母菌，其分类学命名为热带假丝酵母菌Candida Tropicalis.G‑94，已于2017年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M2017402。

【技术特征摘要】
1.一株石油芳香烃降解酵母菌，其分类学命名为热带假丝酵母菌CandidaTropicalis.G-94，已于2017年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：M2017402。2.根据权利要求1所述的一株石油芳香烃降解酵母菌，其特征在于：所述的热带假丝酵母菌G-94菌落特征和生理生化特征为：椭球形，直径为15.50mm，菌落呈乳白色，边缘整齐，中部凸起，表面光滑；过氧化氢酶试验、甲基红试验、产氨试验和产硫化氢试验、V-P试验和苯丙氨酸脱氢酶试验阳性，明胶液化试验、吲哚试验、柠檬酸盐试验、淀粉水解试验、油脂水解试验、硝酸盐还原试验阴性。3.根据权利要求1所述的一株石油芳香烃降解酵母菌，其特征在于：所述的热带假丝酵母菌G-94通过ITSrRNA基因序列比对结果分析，与热带假丝酵母菌CandidaTropicalis的ITSrRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：马立安，詹亚斌，余维初，陶兴玲，何山文，宋淑芬，幸晶晶，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42