一种构建哮喘免疫耐受模型的方法技术

本发明专利技术涉及动物模型构建领域，公开了一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，A.建立免疫耐受小鼠模型：让幼鼠每日饮用含质量分数为0.5‑1.5％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为0.5‑1.5％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为0.5‑1.5％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。本发明专利技术通过给刚断奶的小鼠口服OVA直接获得对OVA的免疫耐受，明显缩短了构建哮喘免疫耐受模型的时间，也减少了构建模型的步骤，大大提高了效率。本发明专利技术解决了现有技术中母乳耐受构建模型的时间非常长，给母鼠雾化，后期给小鼠雾化等步骤非常繁琐，耗资大的技术问题。

A method for constructing immune tolerance model of asthma

The invention relates to the field of animal model construction, and discloses a method of building an immune tolerance model for asthma, including the following steps. A. establishes a mouse model of immune tolerance: let the young mice drink the sterile water with a mass fraction of 0.5 1.5%OVA per day, replace the drinking water per 24h for 7 days, and start drinking sterile water for eighth days; fifteenth The mice were intraperitoneally injected with 125ul with a mass fraction of 0.5 1.5%OVA sensitized mice. On the twenty-second day, the mice were activated by OVA atomization with a mass fraction of 0.5 and 1.5% to stimulate the mice for 1 hours for 7 days, and the identification of the mice model of B. immune tolerance. The present invention can directly obtain the immune tolerance to OVA by oral OVA to the newly weaned mice, obviously shortens the time of constructing the asthma immune tolerance model, and reduces the steps of constructing the model, and greatly improves the efficiency. The invention solves the problem that the time of the breast tolerance construction model in the existing technology is very long, the atomization of the mother mouse, and the atomization of the mice in the later stage is very tedious and costly.

【技术实现步骤摘要】
一种构建哮喘免疫耐受模型的方法
本专利技术涉及动物模型构建领域，尤其涉及了一种构建哮喘免疫耐受模型的方法。
技术介绍
国际上通用的鸡卵清蛋白(OVA)构建哮喘免疫耐受模型的方法大多为母乳耐受，即给刚生完小鼠的母鼠OVA雾化，小鼠在通过母鼠乳汁间接地获得对OVA的免疫耐受,断奶之后获得OVA免疫耐受的小鼠再次接触OVA过敏源不会产生哮喘，而未获得OVA免疫耐受的小鼠再次接触OVA过敏源会产生哮喘表现。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的缺点，提供了一种构建哮喘免疫耐受模型的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决：一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，A.建立免疫耐受小鼠模型：让幼鼠每日饮用含质量分数为0.5-1.5％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为0.5-1.5％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为0.5-1.5％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。本专利技术通过给刚断奶的小鼠口服鸡卵清蛋白(OVA)直接获得对OVA的免疫耐受，明显缩短了构建哮喘免疫耐受模型的时间，也减少了构建模型的步骤，大大提高了效率。作为优选，步骤A中，幼鼠为3-4周龄的小鼠。作为优选，步骤A中，幼鼠为3-4周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠。作为优选，步骤A中，小鼠每日饮用含质量分数为1％OVA的无菌水。作为优选，步骤A中，第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为1％OVA致敏小鼠。作为优选，步骤A中，第22日开始予以含质量分数为1％的OVA雾化激发小鼠1个小时。作为优选，步骤B中，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括测定OVA特异性IgE含量。作为优选，步骤B中，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括，a.进行支气管肺泡灌洗、进行细胞计数和分类、测定气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ细胞因子的含量；b.右肺组织匀浆抽提RNA，用时实定量PCR测定步骤a中细胞因子的mRNA的表达。作为优选，步骤B中，左肺组织进行苏木素-伊红、高碘酸-席夫氏病理染色。本专利技术通过给刚断奶的小鼠口服OVA直接获得对OVA的免疫耐受，明显缩短了构建哮喘免疫耐受模型的时间，也减少了构建模型的步骤，大大提高了效率。本专利技术解决了现有技术中母乳耐受构建模型的时间非常长，前期需要交配，母鼠怀孕，母鼠生产，给母鼠雾化，后期给小鼠雾化，步骤非常繁琐，耗资大，实验效率低下的技术问题。在科研过程中前期构建哮喘免疫耐受模型周期缩短，不但为后期实验做了准备，而且缩短培养模型的时间后，更有利于后期研究；节约了科研成本，更有利于科研工作。同时，口服免疫耐受成功率高，可调控因素更强，更有利于应用于今后的临床研究，适用群体范围不局限于母乳喂养的婴幼儿，可适用于各年龄段群体。附图说明图1是实施例3中OVA特异性IgE含量的测定。图2是实施例3中小鼠BALF中细胞总数及炎性细胞计数图。图3是实施例3中小鼠肺Th2细胞因子mRNA表达图。图4是实施例3中小鼠肺部炎症图。图5是实施例3中口服OVA后气道高反应性图。具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，A.建立免疫耐受小鼠模型：让幼鼠每日饮用含质量分数为0.5％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为0.5％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为0.5％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。实施例2一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，A.建立免疫耐受小鼠模型：让3-4周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠每日饮用含质量分数为1.5％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为1.5％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为1.5％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。实施例3一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，A.建立免疫耐受小鼠模型：让3-4周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠每日饮用含质量分数为1％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为1％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为1％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。步骤B中，如图1-5所示，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括：(1)测定OVA特异性IgE含量。小鼠血清IgE测定具体方法：①包被将captureantibody稀释至CoatingBuffer中,取100ul加至各孔中。ELISA板seal后直接置4℃冰箱过夜。②洗涤弃掉包被液，用washingbuffer(PBST)进行洗涤，方法为吸取PBST250ul加入每孔，用手晃动几下，弃掉洗液，在吸水纸上拍打，然后重新加满，如此重复洗涤3-5次。③封闭最后一次洗涤后反复在吸水纸上拍打，保证每个孔无洗涤液残留，每孔加封闭液250ul，室温放置2h。④洗涤封闭结束后对ELISA板进行洗涤，方法同步骤2。⑤加入标准品及样品梯度稀释标准品，选择7个孔依次2倍稀释浓度，最后一孔作为空白对照，同时将提前准备的小鼠血清稀释50倍后，分别加入对应各孔100ul，室温放置2h。⑥洗涤具体同步骤④。⑦加二抗将detectionantibody稀释在AssayBuffer中后，每孔加入100ul，seal后放置室温1小时。⑧洗剂具体同步骤④。⑨加酶标抗体将HRP-标记的抗体稀释后每孔加100ul，室温放置半小时。⑩洗涤具体同步骤④。显色加显色液至ELISA各孔中，每孔100ul。然后将ELISA板避光室温放置约15min。终止在ELISA板每孔中加终止液(2mol/L硫酸溶液)来终止反应。测OD值：在酶标仪上读数，波长为450nm。然后用软件分析。针对图1的分析：血清ELISA结果提示IgE在哮喘组明显上升，而Control组与Tolerance组之间无明显统计学差异。注：n＝6，采用GraphPadPrism5统计软件处理数据，数据表示为Mean±SEM，两组间比较用独立样本t检验分析，多组计量资料间比较采用two-wayANOVA分析，统计方法以P值<0.05定为具有统计学显著性差异。*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001vsControl组；△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001vsTolerance组。(2)a.进行支气管肺泡灌洗、进行细胞计数和分类、测定气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ细胞因子的含量；b.右肺组织匀浆抽提RNA，用时实定量PCR测定步骤a中细胞因子的mRNA的表达。Ⅰ.肺泡灌洗液细胞计数及染色测试方法：(1)取材：麻醉小鼠后，将小鼠固定在手术台上，小鼠仰卧行气管插管，用针灌洗肺泡1mlPBS，反复抽吸两次，注意不要将肺泡打破，动作轻柔缓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于，包括以下步骤，A.建立免疫耐受小鼠模型：让幼鼠每日饮用含质量分数为0.5‑1.5％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为0.5‑1.5％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为0.5‑1.5％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于，包括以下步骤，A.建立免疫耐受小鼠模型：让幼鼠每日饮用含质量分数为0.5-1.5％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为0.5-1.5％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为0.5-1.5％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。2.根据权利要求1所述的构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于：步骤A中，幼鼠为3-4周龄的小鼠。3.根据权利要求1所述的构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于：步骤A中，幼鼠为3-4周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠。4.根据权利要求1所述的构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于：步骤A中，小鼠每日饮用含质量分数为1％OVA的无菌水。5.根据权利要求1所述的构建哮喘免疫耐受模型的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：施天昀，何燕超，孙伟，揭志军，
申请(专利权)人：上海市第五人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31