快速鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物、DNA条形码、试剂盒、方法和应用技术

本发明专利技术属于物种和菌株鉴定领域，具体涉及一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物组合物、DNA条形码组合物、试剂盒、方法及应用。本发明专利技术的DNA条形码组合物，包括如SEQ ID No.1所示的第一DNA条形码、如SEQ ID No.2所示的第二DNA条形码、如SEQ ID No.3所示的第三DNA条形码、以及如SEQ ID No.4所示的第四DNA条形码，其中所述第一、第二、第三和第四DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的基因组。该DNA条形码能够快速鉴别普洱茶发酵菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007，可以快速准确地将该菌株从易混淆的菌株或同物种内其他菌株中鉴定出来。

【技术实现步骤摘要】
快速鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物、DNA条形码、试剂盒、方法和应用
本专利技术属于物种和菌株鉴定领域，具体涉及一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物组合物、DNA条形码组合物、试剂盒、方法及应用。
技术介绍
普洱茶是一种具有云南地理标识的后发酵茶，其采用大叶种晒青毛茶作为原料，经过一系列工艺制作而成。普洱茶因具有减肥、降血糖血脂、预防和改善心血管疾病、抗衰老、抗癌、消炎、助消化以及养胃等保健功效也备受人们关注。最近几年，普洱茶越来越受欢迎，逐渐增加的市场需求拉动了普洱茶产业的发展，促进了云南地区的经济增长。普洱茶是云南大叶种发酵茶，其发酵生产需要普洱茶发酵生产菌株食腺嘌呤节孢酵母(Blastobotrysadeninivorans)TMCC70007(以下也简称为“TMCC70007”)在内的多种微生物的作用，其中该TMCC70007是发酵过程中的关键菌。目前普洱茶发酵仍然是半自然人工渥堆的经验式发酵，虽然渥堆过程中以少数优势微生物为主的群落相对稳定，但产品的稳定性还存在较大的提升空间。生产过程中也不可避免的存在着一定的安全隐患，为了进一步获得消费者的青睐和市场的认可、突破外贸壁垒、提升普洱茶企业的市场竞争力，必须实现普洱茶生产工艺的人工可控化、清洁化以及高效化，并不断开发新产品、延伸产业链。要做到这些，就必须革新技术，专利技术一系列安全、清洁、高效、人工可控自动化的普洱茶新工艺，才能确保普洱茶产业的健康发展，给国家和人民带来长远利益。随着普洱茶科研的进一步深入，越来越多的人们开始了人工接种发酵普洱茶的探索，目前已经有许多菌株应用于普洱茶人工可控发酵。近年由于市场需求加大，许多规模较小的厂家对普洱茶缺乏系统深入的研究，大肆滥用许多他人专利进行牟利，比如，按照一些接种发酵普洱茶的专利方法，采用一些菌种进行普洱茶发酵等一系列方法，进行普洱茶加工生产等经营活动，大大损害了一些具有相关专利的普洱茶生产企业的经济利益。为确保普洱茶发酵微生物种质资源得到有效保护，防止滥用普洱茶发酵微生物的侵权行为发生，解决在普洱茶人工可控发酵过程中菌种侵权时难以举证的难题，开发对普洱茶发酵用菌株进行快速精准鉴别的方法势在必行，亟需建立其分子鉴定方法，开发通过DNA条形码技术快速鉴别与区分与其相似菌株的方法，以达到通过形态特征与分子数据分析相结合的方法来解决工业生产菌株鉴别和鉴定问题，为普洱茶有控工业发酵工艺开发和资源保护提供理论依据，促进普洱茶产业健康繁荣发展。
技术实现思路
为了克服形态学鉴定用于普洱茶发酵生产的食腺嘌呤节孢酵母菌株所存在的不足，以及基于ITS序列和18SrRNA序列难以区分种内不同菌株的缺陷，本专利技术提供了一组食腺嘌呤节孢酵母的DNA条形码，所述DNA条形码能够快速鉴别普洱茶发酵菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007，可以快速准确地将该菌株从易混淆的菌株或同物种内其他菌株中鉴定出来。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：根据本专利技术的第一方面，提供了一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码组合物，包括如SEQIDNo.1所示的第一DNA条形码、如SEQIDNo.2所示的第二DNA条形码、如SEQIDNo.3所示的第三DNA条形码，以及如SEQIDNo.4所示的第四DNA条形码其中所述第一、第二、第三和第四DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007菌株的基因组。根据本专利技术的第二方面，提供了用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物组合物，包括以下四对引物对：第一引物对：正向引物TAE2-F：5'-TCCCAGCTCTCGATGAGACA-3'，反向引物TAE2-R：5'-CCGATACCGTGACGCTTACA-3'；第二引物对：正向引物Rhomboid-F：5'-CCATGACAATAGTGCGGCTG-3'，反向引物Rhomboid-R：5'-TGTCGTTCAAACCACTCCCA-3'；以及第三引物对：正向引物DUF1647-F：5'-CCAGTTCGTTCGCTAGTCGT-3'，反向引物DUF1647-R：5'-CCTCCCGGCCAACATAAACT-3'；第四引物对：正向引物Sm_F-F：5'-TGTCGTCACGAATTCCCTCT-3'，反向引物Sm_F-R：5'-TGATCCCCTGATACCCACAGA-3'，其中，所述第一引物对为如SEQIDNo.1所示的第一DNA条形码的引物；所述第二引物对为如SEQIDNo.2所示的第二DNA条形码的引物；所述第三引物对为如SEQIDNo.3所示的第三DNA条形码的引物；所述第四引物对为如SEQIDNo.4所示的第四DNA条形码的引物。根据本专利技术的第三方面，提供了一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的试剂盒，包含根据本专利技术的DNA条形码引物组合物。在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括根据本专利技术的DNA条形码组合物。根据本专利技术的第四方面，提供了一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的方法，包括以下步骤：a)提供待测菌株的基因组DNA；b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据本专利技术所述的第一、第二、第三和第四引物对进行PCR扩增，如果未得到由所述四对引物分别扩增得到的PCR产物，则确定所述待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC70007；如果得到由所述第一、第二、第三和第四引物对分别扩增得到的第一、第二、第三和第四PCR产物，则进行以下步骤；c)对所得PCR产物进行测序，得到所述PCR产物各自的DNA序列，所述第一PCR产物的DNA序列为第一DNA序列，所述第二PCR产物的DNA序列为第二DNA序列，所述第三PCR产物的DNA序列为第三DNA序列，所述第四PCR产物的DNA序列为第四DNA序列；d)将步骤c)得到的第一、第二、第三和第四DNA序列按顺序依次进行拼接，得到待测序列；将本专利技术所述的第一、第二、第三和第四DNA条形码按顺序依次进行拼接，得到标准序列；将所述待测序列与所述标准序列进行序列同源性比对，如果序列同源性小于99％，则确定待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC70007；如果序列同源性大于或等于99％，则进行步骤e)；e)将所述待测序列与所述标准序列进行聚类分析，如果所述待测序列与所述标准序列聚类在一起，则确定待测菌株为食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC70007。在本专利技术的方法中，优选地，由所述第一引物对扩增得到的第一PCR产物的长度为551bp；由所述第二引物对扩增得到的第二PCR产物的长度为720bp；由所述第三引物对扩增得到的第三PCR产物的长度为494bp；由所述第四引物对扩增得到的第四PCR产物的长度为492bp。在本专利技术的方法中，优选地，所述PCR扩增的程序为：1)94℃-96℃预变性8分钟；2)94℃-96℃变性45秒，55℃-57℃退火45秒，72℃延伸1分15秒，其中该程序2)进行30-35个循环；3)72℃延伸10分钟。在进一步优选的实施方案中所述PCR扩增的程序为：1)94℃预变性8分钟；2)94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分15秒，其中该程序2)进行30-35个循环；3)72℃延伸10分钟。在本专利技术的方法中，优选地，所述聚类分析为构建系统发育树。根据本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码组合物，包括如SEQ ID No.1所示的第一DNA条形码、如SEQ ID No.2所示的第二DNA条形码、如SEQ ID No.3所示的第三DNA条形码、以及如SEQ ID No.4所示的第四DNA条形码，其中所述第一、第二、第三和第四DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的基因组。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码组合物，包括如SEQIDNo.1所示的第一DNA条形码、如SEQIDNo.2所示的第二DNA条形码、如SEQIDNo.3所示的第三DNA条形码、以及如SEQIDNo.4所示的第四DNA条形码，其中所述第一、第二、第三和第四DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007菌株的基因组。2.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物组合物，包括以下四对引物对：第一引物对：正向引物TAE2-F：5'-TCCCAGCTCTCGATGAGACA-3'，反向引物TAE2-R：5'-CCGATACCGTGACGCTTACA-3'；第二引物对：正向引物Rhomboid-F：5'-CCATGACAATAGTGCGGCTG-3'，反向引物Rhomboid-R：5'-TGTCGTTCAAACCACTCCCA-3'；以及第三引物对：正向引物DUF1647-F：5'-CCAGTTCGTTCGCTAGTCGT-3'，反向引物DUF1647-R：5'-CCTCCCGGCCAACATAAACT-3'；第四引物对：正向引物Sm_F-F：5'-TGTCGTCACGAATTCCCTCT-3'，反向引物Sm_F-R：5'-TGATCCCCTGATACCCACAGA-3'，其中，所述第一引物对为如SEQIDNo.1所示的第一DNA条形码的引物；所述第二引物对为如SEQIDNo.2所示的第二DNA条形码的引物；所述第三引物对为如SEQIDNo.3所示的第三DNA条形码的引物；所述第四引物对为如SEQIDNo.4所示的第四DNA条形码的引物。3.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的试剂盒，包含根据权利要求2所述的DNA条形码引物组合物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，还包含根据权利要求1所述的DNA条形码组合物。5.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的方法，包括以下步骤：a)提供待测菌株的基因组DNA；b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据权利要求2所述的第一、第二、第三和...

【专利技术属性】
技术研发人员：职晓阳，田飞，徐平，唐蜀昆，施佳辉，高林瑞，高慧英，丁章贵，
申请(专利权)人：勐海茶业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53