一种调控植物避荫反应的可变剪切子及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种调控植物避荫反应的可变剪切子及其应用，属于植物基因工程技术领域。所述可变剪切子来自大豆GmERECTA基因编码的同源蛋白GmERa的可变剪切子GmERa.2，GmERa.2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述GmERa.2核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。GmERa.2仅包含胞外结构域中的15个富含亮氨酸重复序列(Leucine‑rich repeat,LRR)，并通过在拟南芥中的遗传转化和生理生化实验，验证过量表达GmERa.2可以改变拟南芥er缺失突变体对荫蔽的敏感性，证明其确实参与了植物的避荫反应。本发明专利技术不仅找到了受体激酶新的剪切形式，并且有利于利用该基因序列对基因进行功能缺失突变或沉默，有利于利用受体激酶GmERECTA基因的特性运用生物技术手段进行作物品种改良，降低间套作中低位作物对高位作物荫蔽的敏感性。

【技术实现步骤摘要】
一种调控植物避荫反应的可变剪切子及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体为一种调控植物避荫反应的可变剪切子及其应用。
技术介绍
中国西南地区大面积推广的玉米-大豆带状间套作种植模式提高了土地产出率和农业可持续发展，但该模式下高位作物玉米对低位作物大豆会产生荫蔽胁迫。为适应自身生长，大豆等农作物会启动避荫反应以应对荫蔽的变化，虽然该反应对单个植株生长繁殖是有利的，但是对于高密度的作物群体而言，会导致作物群体产量下降。所以如何克服作物避荫反应，降低其对产量的影响，是实现高产的一个重要途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述间套作种植模式存在的问题，提供一种调控植物避荫反应的可变剪切子及其应用，将本专利技术可变剪切子应用于植物避荫反应中，可以降低间套作中低位作物对荫蔽胁迫的敏感性，从而提高间套作低位作物的产量。本专利技术目的通过以下技术方案来实现：一种调控植物避荫反应的可变剪切子，所述可变剪切子来自大豆GmERECTA基因编码的同源蛋白GmERa的可变剪切子GmERa.2，所述GmERa.2的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。进一步，所述GmERa.2的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，所述可变剪切子在调控植物避荫反应中的应用。作为本专利技术所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，所述可变剪切子在调控拟南芥避荫反应中的应用。作为本专利技术所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，所述可变剪切子在调控拟南芥避荫反应中的应用，包括以下步骤：1)从大豆中克隆出GmERa.2；2)将大豆GmERa.2的核苷酸序列构建的表达载体pBASTA-35S-GWR-GFP转到拟南芥ERECTA突变体er-3中进行过量表达，检测基因转录水平和蛋白水平的表达情况。作为本专利技术所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，所述步骤1)的克隆采用Gateway克隆法，包括以下步骤：A、GmERa.2基因片段通过两轮PCR扩增连上attB序列；B、连上attB序列的基因经过胶回收进行BP反应，构建到入门载体pDONR/zeo；C、BP反应产物转化DH5α，涂到含有50μg/mlzeocin抗性的LB培养基上，37℃过夜培养，菌落PCR鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50μg/mlzeocin液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，用试剂盒提取质粒，质粒酶切鉴定后测序；D、测序正确后，将构建好的入门载体进行LR反应，构建到pBASTA-35S-GWR-GFP表达载体；E、LR反应产物转化DH5α，涂到含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，菌落PCR鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养，提取质粒，酶切鉴定正确后，得到含有目的基因的质粒pBASTA-35S-GmERa.2-GFP；最后将质粒转化农杆菌GV3101，涂到50μg/ml卡那霉素+50μg/ml庆大霉素LB固体培养基上，28℃培养2d，菌落PCR鉴定为阳性克隆后于终浓度为15％的甘油中保存该菌种。作为本专利技术所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，步骤A中，所述第一轮PCR扩增时所用引物为：5’-AAAAAGCAGGCTTCATGAAACAGCTGGAAAATCTG-3’和5’-AGAAAGCTGGGTCCAAGGATATAATGTTCTGAAGC-3’；所述第二轮PCR扩增时所用引物为：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’和5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’。作为本专利技术所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，所述菌落PCR鉴定所采用的引物为5’-ATGAAACAGCTGGAAAATCTG-3’和5’-CAAGGATATAATGTTCTGAAGC-3’。作为本专利技术所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，所述步骤E中，酶切鉴定体系为：NEBBuffer1.11μl；BsrGI0.1μl；重组质粒pBASTA-35S-GmERa.2-GFP8.9μl，于37℃水浴中反应4h。作为本专利技术所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，步骤2)中，将构建好的表达载体pBASTA-35S-GmERa.2-GFP转到拟南芥ERECTA突变体er-3中采用浸花法，包括以下步骤：A、农杆菌侵染液的制备：按LB液体的两倍体积配制5％蔗糖溶液，加入SilwetL-77至终浓度为0.3‰；将农杆菌于6500rpm离心5min，收集菌体，并重悬浮于5％蔗糖溶液，OD600为0.8即可；B、花侵染：待拟南芥抽薹10cm时开始用农杆菌介导的浸花转化，将花蕾在上述含有终浓度为0.3‰SilwetL-77，5％蔗糖溶液的农杆菌液体中浸染20秒，将浸染过的植株置于弱光下12小时后继续正常光照生长，待一周后进行第二次浸染，直到花期结束，待种子成熟时，收获的种子中含有转基因种子，转基因种子种下一周后，叶片喷施1‰草甘膦筛选转基因苗，抗草甘膦的苗即为GmERa.2基因的过量表达植株。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供一种调控植物避荫反应的可变剪切子，来自大豆GmERECTA的同源蛋白GmERa的可变剪切子GmERa.2。GmERa.2仅包含胞外结构域中的15个富含亮氨酸重复序列(Leucine-richrepeat,LRR)，与常见受体激酶的可变剪切大不相同，并通过在拟南芥中的遗传转化和表型分析检测过量表达GmERa.2可以恢复拟南芥er-3缺失突变体对荫蔽的敏感性，证明其确实参与了植物的避荫反应。本专利技术不仅找到了受体激酶新的剪切形式，并且有利于利用受体激酶GmERECTA基因的特性运用生物技术手段进行作物品种改良，降低间套作中低位作物对高位作物荫蔽的敏感性。附图说明图1为GmERa的两种可变剪切子GmERa.1和GmERa.2的蛋白序列与拟南芥的同源蛋白AtER的蛋白序列比对图。图2为实施例1中采用RT-PCR对基因转录水平进行检测的结果。图3为实施例1中采用Westernblot对蛋白的表达情况进行检测的结果。图4为在白光和荫蔽生长条件下，Col-0，ER的缺失突变体er-3，ER基因的突变体er-3中过量表达GmERa.2的两个转基因株系(pBASTA-35S-GmERa.2-GFPiner-3#1和pBASTA-35S-GmERa.2-GFPiner-3#2)的表型。图5为在白光和荫蔽生长条件下，Col-0，ER的缺失突变体er-3，ER基因的突变体er-3中过量表达GmERa.2的两个转基因株系(pBASTA-35S-GmERa.2-GFPiner-3#1和pBASTA-35S-GmERa.2-GFPiner-3#2)的下胚轴长度统计结果。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。一种调控植物避荫反应的可变剪切子，所述可变剪本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调控植物避荫反应的可变剪切子，其特征在于，所述可变剪切子来自大豆GmERECTA基因编码的同源蛋白GmERa的可变剪切子GmERa.2，所述GmERa.2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种调控植物避荫反应的可变剪切子，其特征在于，所述可变剪切子来自大豆GmERECTA基因编码的同源蛋白GmERa的可变剪切子GmERa.2，所述GmERa.2的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.如权利要求1所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子，其特征在于，所述GmERa.2的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。3.如权利要求1所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，其特征在于，所述可变剪切子在调控植物避荫反应中的应用。4.如权利要求3所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，其特征在于，所述可变剪切子在调控拟南芥避荫反应中的应用。5.如权利要求4所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，其特征在于，所述可变剪切子在调控拟南芥避荫反应中的应用，包括以下步骤：1)从大豆中克隆出GmERa.2；2)将大豆GmERa.2的核苷酸序列构建的表达载体pBASTA-35S-GWR-GFP转到拟南芥ERECTA突变体er-3中进行过量表达，检测基因转录水平和蛋白水平的表达情况。6.如权利要求5所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，其特征在于，所述步骤1)的克隆采用Gateway克隆法，包括以下步骤：A、GmERa.2基因片段通过两轮PCR扩增连上attB序列；B、连上attB序列的基因经过胶回收进行BP反应，构建到入门载体pDONR/zeo；C、BP反应产物转化大肠杆菌DH5α，涂到含有50μg/mlzeocin抗性的LB培养基上，37℃过夜培养，菌落PCR鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50μg/mlzeocin液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，用试剂盒提取质粒，质粒酶切鉴定后测序；D、测序正确后，将构建好的入门载体进行LR反应，构建到pBASTA-35S-GWR-GFP表达载体；E、LR反应产物转化DH5α，涂到含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，菌落PCR鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养，提取质粒，酶切鉴定正确后，得到含有目的基因的质粒pBASTA-35S-GmERa.2-GFP；最后将质粒转化农杆菌GV3101，涂...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜俊波，蒋亨珂，黎艳，孙歆，余靓，刘江，舒凯，刘卫国，杨峰，王小春，雍太文，杨文钰，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51