一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，属于大分子检测领域。本发明专利技术利用一定条件下，壳寡糖能与宝石红结合形成离子缔合物，使共振散射强度显著增强，加入十二烷基硫酸钠作为增敏剂提高其灵敏度。通过共振散射强度与壳寡糖在一定的浓度范围内呈线性关系，以此作为壳寡糖的定量基础，建立了测定壳寡糖的共振瑞利散射法。本方法测定受离子浓度和干扰物的影响，在实际样品测定中，需控制离子浓度在0.05mol/L‑0.20mol/L的标准品做定量标准，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法
本专利技术涉及一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，属于大分子检测领域。
技术介绍
壳寡糖(chitosanoligosaccharide/chitooligosaccharide，COS)，又称低寡葡萄糖、低寡氨基葡萄糖等，是一种碱性氨基寡糖，由2-氨基葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成，其中含有部分的乙酰氨基葡萄糖残基。壳寡糖来源广泛，安全无毒，水溶性好，有抗氧化、抑菌、抗肿瘤、增强免疫力等多种生物活性，已引起国内外医药研究者的广泛关注。因此，壳寡糖的准确定量显得十分重要，建立简便高效的方法测定壳寡糖含量有着重要的意义，这将进一步推进壳寡糖在各个领域的应用。目前测定壳寡糖的常用方法依然存在一些不足，如比色法：此方法经凝胶渗透色谱验证，能较为准确地判断壳寡糖的平均寡合度。虽然比色法技术简单，对设备要求不高，成本较低，但由于其准确性不高，因此有必要开发一种新的可准确测定壳寡糖的分析方法；色谱法：薄层层析法虽然可以分析壳寡糖，价格低廉，但此方法操作时间长，只能进行微量生产，无法定量，薄层-比色法可用于壳寡糖常规检验。但是，要大规模地对壳寡糖分离分析还需要不断地寻求新的技术。而目前国内外，利用简便、快速、灵敏度高的共振瑞利散射方法直接测定壳寡糖含量的相关研究较少，因此，共振瑞利散射法测定壳寡糖有着很大的研究空间及重要意义。基于此，本专利技术提供一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法。
技术实现思路
为了克服现有技术中对于成品中壳寡糖的含量难以定量，操作技术繁琐的技术不足，本专利技术提供一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，本专利技术利用一定条件下，壳寡糖能与宝石红结合形成离子缔合物，使共振散射强度显著增强，加入十二烷基硫酸钠作为增敏剂提高其灵敏度。通过共振散射强度与壳寡糖在一定的浓度范围内呈线性关系，以此作为壳寡糖的定量基础，建立了测定壳寡糖的共振瑞利散射法。本方法测定受离子浓度和干扰物的影响，在实际样品测定中，需控制离子浓度在0.05mol/L-0.20mol/L的标准品做定量标准，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点。一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，其包括下述步骤：1)绘制△I和不同浓度的壳寡糖的标准曲线向10mL比色管中加入1.0mL的B-R缓冲溶液，一定浓度梯度的壳寡糖标准溶液，1.0mL浓度为0.086mol/L的增敏剂，以及1.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的宝石红溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，将其置于室温10min后于F-2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，分别记录含壳寡糖的各检测体系在λ＝470nm处体系的共振散射强度I，其中试剂空白在λ＝470nm处体系的共振散射强度I0，并计算△I＝I-I0，建立△I与壳寡糖浓度的标准曲线C；2)10μg/mL的样品工作液的制备：将壳寡糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。3)样品中壳寡糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在470nm处测定其散射值I，并计算△I＝I–I0，将△I代入线性回归方程求得样品中壳寡糖的含量，同时做加标回收试验。如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，所述的B-R缓冲溶液由0.04mol/L混合酸与0.2mol/LNaOH溶液按不同比例配制而成。如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，所述的混合酸由正磷酸、冰乙酸和硼酸按不同比例配制而成。如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，所述的B-R缓冲溶液的pH为4.9。如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，所述增敏剂为吐温20，吐温80，OP乳化剂,十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠中的一种如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，所述增敏剂为十二烷基硫酸钠。如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，步骤1中溶液的加入顺序为首先加入宝石红溶液，其次加入十二烷基硫酸钠溶液，再次加入RB缓冲溶液，最后加入壳寡糖溶液。如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，壳寡糖的浓度范围0.5μg/mL-2.5μg/mL。样品前处理：将壳寡糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。取样品工作液1mL，按实验方法进行测定，在470nm处测定其吸光度值I，并计算△I＝I-I0，将△I代入线性回归方程求得样品中壳寡糖的含量，同时做加标回收试验。试验例：1.壳寡糖-宝石红-十二烷基硫酸钠体系的共振瑞利散射光谱图1为体系的共振散射光谱图。由图1可知，COS，SDS和宝石红本身的散射值较低，但当COS与宝石红及SDS三者结合后散射值明显增大，并在470nm处有散射峰。实验的空白组散射值较低，且实验组随着COS的浓度的增大，体系的散射值增大，存在较好的线性关系。2.BR缓冲溶液的pH对体系散射值的影响于10mL的比色管中，各依次加入2.0mLpH＝3，4，5，6的B-R缓冲液，1.0mL浓度为10μg/mL的壳寡糖溶液，以及2.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的宝石红溶液，用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀振荡90s，置于常温静置30min。于F-2500型荧光分光光度计上以λex＝λem进行同步扫描，得到共振瑞利散射光谱。结果见图2和图3，缓冲溶液的酸度对该反应体系有着显著的影响，在pH＝5.0附近时散射值较大，通过酸度的细化实验，最终最佳酸度条件确定在pH＝4.9处。3.不同缓冲液对于体系散射值的影响分别考察了B-R缓冲溶液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液和甘氨酸-盐酸缓冲溶液3种缓冲溶液对体系散射值的影响。按照实验方法，改变加入的缓冲溶液，得到各个缓冲溶液的散射值。结果见图2、图4、图5，体系在B-R缓冲溶液中灵敏度最高，散射值最大，故最佳缓冲溶液选择为B-R缓冲溶液。4.缓冲液的加入量对散射值的影响缓冲溶液为实验体系提供合适的酸度结合环境，其加入量对离子缔合物的形成有着一定的影响，不改变其他实验条件，改变pH＝4.9的B-R缓冲溶液的加入量为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3mL，测定其散射值。结果见图6，B-R缓冲溶液加入量为1.5mL和2.5mL时均出现峰值，且加入量为1.5mL时ΔI较大，故选择加入B-R缓冲液加入量为1.5mL。5.宝石红加入量对散射值的影响宝石红作为染料探针与目标物质壳寡糖结合，其加入量直接影响着离子缔合物的形成，不改变其他实验条件，改变浓度为1.0×10-4mol/L的宝石红的加入量为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3mL，测定其散射值。结果见图7，宝石红的加入量对该反应体系有显著影响，可以看出，随着宝石红染本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，其包括下述步骤：1)绘制△I和不同浓度的壳寡糖的标准曲线向10mL比色管中加入1.0mL的B‑R缓冲溶液，一定浓度梯度的壳寡糖标准溶液，1.0mL浓度为0.086mol/L的增敏剂，以及1.0mL浓度为1.0×10

【技术特征摘要】
1.一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，其包括下述步骤：1)绘制△I和不同浓度的壳寡糖的标准曲线向10mL比色管中加入1.0mL的B-R缓冲溶液，一定浓度梯度的壳寡糖标准溶液，1.0mL浓度为0.086mol/L的增敏剂，以及1.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的宝石红溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，将其置于室温10min后于F-2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，分别记录含壳寡糖的各检测体系在λ＝470nm处体系的共振散射强度I，其中试剂空白在λ＝470nm处体系的共振散射强度I0，并计算△I＝I-I0，建立△I与壳寡糖浓度的标准曲线C；2)10μg/mL的样品工作液的制备：将壳寡糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。3)样品中壳寡糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在470nm处测定其散射值I，并计算△I＝I–I0，将△I代入线性回归方程求得样品中壳寡糖的...

【专利技术属性】
技术研发人员：白研，苏政权，陈红红，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44