一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法技术

本发明专利技术公开了一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法，该方法通过建立细粒棘球蚴感染小鼠模型以及体外原头蚴与巨噬细胞共培养体系，检测巨噬细胞PPARs的表达水平及其对巨噬细胞极化的调节，并在此基础上抑制PPARs通路，进一步探讨PPARs对巨噬细胞极化的影响，及在包虫病免疫逃逸过程中的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法
本专利技术属于生物
，涉及一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法。
技术介绍
包虫病(Hydatiddisease)又称棘球蚴病，是棘球蚴绦虫(Echinococcusgranulosus)的幼虫在人畜体内寄生，产生的一种人畜共患的慢性感染性疾病，也是地方性感染性疾病，在牧区高发。常见的有囊型包虫病(Cysticechinococcosis,CE)和泡型包虫病(Alveolarechinococcosis,AE)两种，分别是由细粒棘球蚴和多房棘球蚴幼虫寄生在人畜体内而感染的；在我国常见的是由细粒棘球蚴绦虫引起的囊型包虫病(Cysticechinococcosis,CE)。这对公共卫生和经济造成重大影响。包虫病全球分布广泛，常见于非洲、南美、欧亚大陆和中国北部等，在我国主要分布于较贫困边远的农牧区如新疆、西藏、内蒙古、四川、青海和黑龙江等地，其中新疆较为高发。该病属于自然疫源性疾病，也是人畜共患病，主要在动物与人之间以及动物与动物之间相互感染传播形成循环。人和牛、羊、马等食草类动物为中间宿主，可经口误食犬科类动物排出的含虫卵的粪便而感染，近几年经流行病学调查证实棘球蚴病疫区呈逐年扩大趋势，即由西北部开始向东南部发展，由牧区向非牧区扩散。每年都会有近四十万的人饱受该病的困扰和几千万人受到威胁，每年对畜牧业造成的经济损失高达十几亿。由于包虫病对人类身体健康危害严重，同样对畜牧业的发展造成极大威胁，在世界范围内被认为是严重危害公共卫生、环境安全与经济发展的问题。因此有控制传染源，切断传播途径，有效的预防包虫病成为一个至关重要的问题。包虫幼虫通过人体组织屏障和抵抗宿主早期炎性反应及免疫反应，侵入宿主组织后生长缓慢,往往数年才出现症状。主要寄生在肝、肾和肠系膜等部位，以机械性损害为主，受累部位常表现为轻微的疼痛和脏器功能障碍，也可表现为过敏反应和毒性反应，严重时甚至可能因过敏性休克致死。目前包虫病的治疗有外科手术和药物治疗。临床上一般首先采取手术治疗，其次为药物治疗，这样可以有效地提高治愈率，减少复发率，然而包虫病的包囊较脆弱易破裂，在手术过程中可能导致其损坏意外破裂，包囊中的部分原头蚴可能进入机体各个部位，造成严重的二次感染，这一过程大大提高了包虫病治疗难度。目前，对包虫病的致病机制仍不清楚，尚无有效的早期诊断方法，预防效果不明显。因此，研究包虫病的感染机制，尤其是早期虫体如何逃避宿主的免疫杀伤作用显得尤为重要，这对包虫病的预防治疗非常重要。细粒棘球蚴感染宿主后引起机体的免疫应答机制十分复杂，在人体免疫力正常的时候可能持续几年甚至几十年都无症状，呈潜伏生长转移，造成持续而严重的慢性损害。免疫保护和免疫损伤并存是主要免疫表现，而包虫能在宿主体内存活主要依赖于有效的免疫逃逸机制，棘球蚴感染早期可改变宿主的免疫反映形式：Th1细胞免疫向Th2细胞转换，从而起到逃避宿主免疫杀伤的作用。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator-activatedreceptors,PPARs),是一种致密分子构成的类固醇受体,属于由配体激活的Ⅱ型核受体超家族成员。分为三个亚型即α、β和γ。不同的亚型其表达部位及发挥的作用也不尽相同。PPAR-α主要在人和鼠的免疫细胞上表达，包括巨噬细胞、淋巴细胞以及树突状细胞，以及肝、肾、褐色脂肪组织(BAT),在脂肪酸氧化、应激、炎症反应以及肝脏的纤维化中起重要。PPAR-γ主要在脂肪组织、肝、肾、单核巨噬细胞、平滑肌细胞等表面表达。有研究显示，PPAR-γ的功能复杂多样，它参与抗炎反应，调节糖脂代谢，诱导肿瘤细胞的凋亡和分化，抑制肿瘤血管生成，抗动脉粥样硬化，改善心功能和参与心室重构等。PPARs，作为核受体超家族的一员，1990年由Issemann等发现。自1990年Issemann报道了此类能被过氧化物酶体增殖物(如贝特类降脂药、塑料成型剂、邻苯二甲酸醋及除草剂等)激活的核内受体以来,已有三种PPARs亚型被分离鉴定,这3种亚型在结构及功能上均有差异。近年来,众多研究显示PPARs与许多疾病形成密切相关。以脂类代谢为例，PPARs在炎症反应中发挥重要作用。在成熟的巨噬细胞中，PPAR-γ配体罗格列酮在转录水平上抑制单核细胞趋化蛋白(MCP-1)的表达，它是AS炎症过程启动的重要因子之一。PPAR-γ-LXR信号通路通过调节ABCA1/G1转运体来巨噬细胞内胆固醇外流，Ozsa等发现]吡格列酮有抗动脉粥样硬化的作用，其机制可通是过增加某些基因的表达，增强巨噬细胞中胆固醇的外流，有效缓解动脉粥样硬化。此外,PPAR-α和PPAR-γ激活剂均可通过降低NF-κB活性,在转录水平抑制炎症因子如TNF–α、IL-1β、IL-6和iNOS等表达。另外在肥胖的研究中发现脂肪组织巨噬细胞的活化可能与慢性炎症和免疫异常密切相关。巨噬细胞来自血液中的单核细胞，是由骨髓中的粒系-单系祖细胞分化而成，分布于机体的各个组织中，在不同的部位名称不同，如在脑组织中称小胶质细胞(microglialcells)，在肝中称为库佛细胞(Kupffercells，KC)，在肺中称为肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophage)等。巨噬细胞是一类具有异质性的免疫细胞，能吞噬杀伤病原体，清除损伤和衰老的细胞，是机体非特异性免疫的重要组成部分。巨噬细胞是存在于机体组织中的具有功能可变和表型可变的异构细胞，对特定的微环境信号能产生功能适应，参与不同的免疫反应。不同微环境对巨噬细胞的刺激可使其产生不同功能的细胞亚型，Th1型细胞因子如LPS可以促使巨噬细胞向M1型极化，相反Th2型细胞因子如IL-4可以促使巨噬细胞向M2型极化。M1型和促炎相关，而M2型和抗炎相关。与M1型巨噬细胞相关的因子有TNF–α、IL-1β、IL-6、iNOS、和MCP-1等，与M2型相关的细胞因子有IL-10、MR(甘露糖受体)、Arg-1、TGF-β和Fizz-1等。巨噬细胞在不同环境下的极化受不同因素的调节，核因子κB(NF-κB)通路，信号传导与转录激活因子(STAT)通路，PPARs通路等转录因子在其中发挥关键的作用，其中PPARs通路对M2型巨噬细胞的极化起重要调节作用，PPAR-γ可通过抑制性蛋白IκB来抑制NF-κB、以及其他炎症因子在转录水平的表达来抑制炎症。巨噬细胞在不同微环境表型的可变性在很多疾病的发生发展过程中发挥重要的作用，巨噬细胞在炎症的产生发展和恢复过程中起重要的作用，这主要依赖于其对不同微环境的极化表型不同。在包虫病的研究过程中发现宿主感染细粒棘球蚴早期可出现明显的细胞炎性反应。Meeusne等曾报道绵羊感染包虫病后3-5d即可出现中性粒细胞和巨噬细胞浸润，感染三到四周后可见白细胞增多，且主要是巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞水平升高。根据前期实验我们猜测巨噬细胞可能在免疫逃逸中起重要作用，但具体是何种原因导致包虫病时这些因子表达的改变，仍然了解甚少。而PPARs与包虫病的关系及其表达水平，目前国内外尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法。通过建立细粒棘球蚴感染小鼠模型以及体外原头蚴与巨噬细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.体外实验1.1RAW264.7细胞与原头蚴共培养，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节用RAW264.7细胞与原头蚴共培养，在12、24、36、48、72h分别收取细胞和上清，用qRT‑PCR的方法检测PPAR‑γ、PPAR‑α以及巨噬细胞M1型相关因子TNF‑α、MCP‑1、IL‑1β，M2型巨噬细胞相关因子Arg‑1、TGF‑β、Fizz‑1的mRNA水平；ELISA方法检测MR和Arg‑1的蛋白表达水平；1.2小鼠腹腔巨噬细胞与原头蚴共培养，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节；1.3小鼠腹腔巨噬细胞与原头蚴共培养，阻断PPARs通路，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节实验组提前用PPARγ/α抑制剂处理腹腔巨噬细胞2小时，对照组加等量PBS，然后再与原头蚴共培养，48h收取细胞，重复上述实验；步骤2.体内试验2.1建立原头蚴感染小鼠动物模型，检测PPARs表达水平和对巨噬细胞极化的调节；2.2建立原头蚴感染小鼠动物模型，阻断PPARs通路检测其对巨噬细胞极化的调节在建立动物感染模型前实验组用PPARγ/α抑制剂处理小鼠，对照组用等量PBS处理，24h后再建模，15天时处死小鼠收集细胞，重复上述实验。...

【技术特征摘要】
1.一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.体外实验1.1RAW264.7细胞与原头蚴共培养，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节用RAW264.7细胞与原头蚴共培养，在12、24、36、48、72h分别收取细胞和上清，用qRT-PCR的方法检测PPAR-γ、PPAR-α以及巨噬细胞M1型相关因子TNF-α、MCP-1、IL-1β，M2型巨噬细胞相关因子Arg-1、TGF-β、Fizz-1的mRNA水平；ELISA方法检测MR和Arg-1的蛋白表达水平；1.2小鼠腹腔巨噬细胞与原头蚴共培养，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节；1.3小鼠腹腔巨噬细胞与原头蚴共培养，阻断PPARs通路，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节实验组提前用PPARγ/α抑制剂处理腹腔巨噬细胞2小时，对照组加等量PBS，然后再与原头蚴共培养，48h收取细胞，重复上述实验；步骤2.体内试验2.1建立原头蚴感染小鼠动物模型，检测PPARs表达水平和对巨噬细胞极化的调节；2.2建立原头蚴感染小鼠动物模型，阻断PPARs通路检测其对巨噬细胞极化的调节在建立动物感染模型前实验组用PPARγ/α抑制剂处理小鼠，对照组用等量PBS处理，24h后再建模，15天时处死小鼠收集细胞，重复上述实验。2.根据权利要求1所述的PPARs对巨噬...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪玲，吴向未，陈聪哲，
申请(专利权)人：陈雪玲，
类型：发明
国别省市：新疆,65