选择性识别蛋白质的纸基双印迹材料及制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种选择性识别蛋白质的纸基双印迹材料及其制备方法与应用。该制备方法包括氧化石墨烯‑血晶素复合物固定在滤纸材料表面以及滤纸表面制备双印迹材料。该纸基双印迹材料用于蛋白质的选择性识别和定量检测。该纸基双印迹材料具有成本低廉、绿色环保、操作简单、容易回收以及对蛋白质特异性识别的特性，特别是其具备了良好的显色、保水和亲水特性，实现蛋白质大分子的快速、高通量检测。

【技术实现步骤摘要】
选择性识别蛋白质的纸基双印迹材料及制备方法与应用
本专利技术涉及环境分析领域，具体涉及选择性识别蛋白质的纸基双印迹材料及其制备方法与应用。
技术介绍
甲状腺球蛋白是甲状腺中的一种碘化糖蛋白，由甲状腺滤泡细胞分泌，可作为甲状腺素前体物质，在甲状腺过氧化物酶的作用下碘化偶联生成甲状腺素；也是甲状腺素合成和分泌过程中非常重要的结合和转运蛋白，与甲状腺正常生理功能有着密切的联系，甲状腺球蛋白水平常常作为评定甲状腺功能的指标之一。甲状腺素干扰物是一类通过影响甲状腺素水平和靶细胞对激素的反应性两方面，来干扰甲状腺素合成、分泌、转运、结合、效应或清除的外来物。近年来对甲状腺素干扰物的研究较多，但是甄别是识别、研究和控制甲状腺素干扰物污染的前提。甲状腺球蛋白作为甲状腺素的前体物质，因此，凡是影响甲状腺球蛋白的合成与分泌的物质都是甲状腺素干扰物，那么通过测定甲状腺球蛋白就能对这类干扰物进行甄别和初筛。FRTL-5细胞株是体外培养的大鼠甲状腺滤泡细胞，它具有正常甲状腺滤泡细胞分泌甲状腺球蛋白的功能，是目前唯一有功能的甲状腺细胞株，可用于体外评价已知甲状腺素干扰物和筛选未知甲状腺素干扰物。常规甲状腺球蛋白检测方法主要是放射免疫法、化学发光法和免疫荧光法，然而这些检测技术都存在样品前处理繁琐、成本高、专业性强、放射性等缺点，不仅危害检测人员健康，而且不适合基层实验室开展响应。因此，开发一种快速、便捷、灵敏、准确的高通量检测技术非常有必要。纸材料具有来源广泛、成本低廉、便于随意裁剪/折叠、环境友好型的特点，且纸纤维丰富比表面积大，有利于材料的附着与修饰。纸色谱技术也常常用于复杂样品多个组分的分离，并结合光谱学技术进行分析。但是滤纸本身吸附容量太低、因而分离效能较差，达不到灵敏、准确检测的要求，无法满足实际复杂样品分析的需要。表面印迹技术是指在基质表面获得空间和结合位点与模板分子完全匹配的聚合物制备技术，具有构象预定性、识别特异性、环境耐受性和使用寿命长等特点，能够发挥类似于生物抗体的作用。目前研究主要是在纸基材料表面修饰荧光物质，并在荧光物质表面合成分子印迹聚合物，借助基底材料的荧光信号进行模板分子的快速检测。但是一方面修饰在纸表面的荧光物质信号响应较弱，检测灵敏度受限，而且需要荧光分光光度计或者荧光显微镜等设备；另一方面表面印迹技术常用引发剂主要是偶氮二异丁腈、过硫酸铵、过氧化二苯甲酰和N，N-二甲基苯胺等难溶性有毒化合物，容易使蛋白质变性。本专利技术以石墨烯-血晶素复合物、过氧化氢和乙酰丙酮构成三元引发体系，引发聚合反应的发生；石墨烯-血晶素复合物可以吸附蛋白质，并与蛋白质相互作用；还可以借助石墨烯-血晶素复合物的过氧化物酶样活性进行显色，显色后对纸基进行扫描图像处理，以图像灰度为检测信号，开发出特异性识别蛋白质的无毒、无损害、简便、快速、经济、灵敏的分析技术。
技术实现思路
本专利技术解决了识别蛋白质技术在普及性和安全方面不足的问题，提供了一种纸基双印迹材料及其制备方法与应用。按照本专利技术的一个方面，提供了一种选择性识别蛋白质的纸基双印迹材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)氧化石墨烯-血晶素复合物在滤纸材料表面的固定(1-1)运用负压将氧化石墨烯-血晶素复合物固定在滤纸材料表面；(2)纸基双印迹材料的制备(2-1)将功能单体丙烯酰胺、模板蛋白质和模板3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶解在磷酸盐缓冲溶液中，充分混匀后，20℃-37℃孵育10min-30min；(2-2)将步骤(1-1)制备得到的表面固载有氧化石墨烯-血晶素复合物的滤纸材料加入到步骤(2-1)所得的溶液中，加入交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，并加入催化反应体系过氧化氢和乙酰丙酮，在20℃-37℃下避光聚合12h-24h；(2-3)将步骤(2-2)所得滤纸材料用洗脱液洗去模板蛋白质和模板3,3',5,5'-四甲基联苯胺后，得到选择性识别模板蛋白质和模板3,3',5,5'-四甲基联苯胺的纸基双印迹材料。优选地，步骤(2-1)中所述的功能单体丙烯酰胺用于提供乙烯双键、氨基和酰胺基团与模板蛋白质和模板3,3',5,5'-四甲基联苯胺聚合反应，形成模板蛋白质和模板3,3',5,5'-四甲基联苯胺的空间立体结构。优选地，步骤(1-1)所述的氧化石墨烯-血晶素复合物具有过氧化物酶样活性，用于催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色作为检测信号。优选地，步骤(2-1)中的功能单体丙烯酰胺在氧化石墨烯-血晶素复合物与过氧化氢和乙酰丙酮的引发作用下，发生乙烯双键的断裂加成反应，并在交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的作用下，交联形成多聚物。优选地，步骤(2-1)所述的丙烯酰胺、模板蛋白质和模板3,3',5,5'-四甲基联苯胺的物质的量之比为(7428-37141)：1：(1098-5492)。优选地，步骤(2-2)所述的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过氧化氢和乙酰丙酮的物质的量之比为1:(99-512):(1-12)。按照本专利技术的另一方面，提供了选择性识别蛋白质的纸基双印迹材料，由权利要求1-6任一所述方法制备得到。按照本专利技术的另一方面，提供了选择性识别蛋白质的纸基双印迹材料的应用，该纸基双印迹材料用于蛋白质的选择性识别或蛋白质的定量检测。优选地，所述纸基双印迹材料在选择性识别蛋白质之后，向反应体系中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢；3,3',5,5'-四甲基联苯胺竞争结合双印迹残留位点；氧化石墨烯-血晶素过氧化物酶样活性催化过氧化氢释放自由基，3,3',5,5'-四甲基联苯胺结合自由基并呈现蓝色，根据颜色的灰度值计算出蛋白质的浓度。优选地，该纸基双印迹材料用于甲状腺球蛋白质的选择性识别或甲状腺球蛋白质的定量检测。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：(1)纸材料来源广泛、成本低廉，制备的纸基双印迹材料能够作为吸附剂，实现复杂样本中甲状腺球蛋白的高选择性识别萃取，操作过程不需要其他设备和仪器的辅助，就能够实现材料的回收利用，较为简单快捷。(2)氧化石墨烯-血晶素一方面可以通过ππ作用吸附蛋白质，增加纸基双印迹材料对蛋白质的吸附容量；另一方面氧化石墨烯-血晶素复合物也可以和过氧化氢、乙酰丙酮作为三元引发体系，无毒，易分散溶解，可催化聚合反应的发生；同时该氧化石墨烯-血晶素复合物具有过氧化物酶样活性，用于催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色作为检测信号。(3)借助纸材料可裁剪/修饰和透光性好的特性，通过常规显色技术即可完成蛋白质的快速检测，能够满足便携式快速分析。相对于现有技术中的碳材料、磁性材料表面印迹聚合物而言，纸基双印迹材料还有绿色环保、亲水性高、廉价易得的优势，能够实现复杂生物样本中目标分子的高选择性识别，既可以用于蛋白质的选择性检测分析，也可以用于蛋白质的高效吸附/富集，具有较好的实际应用价值。附图说明图1是氧化石墨烯-血晶素复合物吸附甲状腺球蛋白的原子力显微镜图；图2是纸基表面修饰氧化石墨烯-血晶素的电镜图；图3是纸基表面聚合反应发生前(a)和纸基表面聚合反应发生后(b)图；图4是纸基双印迹材料(a,b)和纸基非印迹材料(c,d)的电镜图；图5是纸基双印迹材料和纸基非印迹材料(空白对照)对甲状腺球蛋白的吸附效果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择性识别蛋白质的纸基双印迹材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)氧化石墨烯‑血晶素复合物在滤纸材料表面的固定(1‑1)运用负压将氧化石墨烯‑血晶素复合物固定在滤纸材料表面；(2)纸基双印迹材料的制备(2‑1)将功能单体丙烯酰胺、模板蛋白质和模板3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶解在磷酸盐缓冲溶液中，充分混匀后，20℃‑37℃孵育10min‑30min；(2‑2)将步骤(1‑1)制备得到的表面固载有氧化石墨烯‑血晶素复合物的滤纸材料加入到步骤(2‑1)所得的溶液中，加入交联剂N,N‑亚甲基双丙烯酰胺，并加入过氧化氢和乙酰丙酮，在20℃‑37℃下避光聚合12h‑24h；(2‑3)将步骤(2‑2)所得滤纸材料用洗脱液洗去模板蛋白质和模板3,3',5,5'‑四甲基联苯胺后，得到选择性识别模板蛋白质和模板3,3',5,5'‑四甲基联苯胺的纸基双印迹材料。

【技术特征摘要】
1.一种选择性识别蛋白质的纸基双印迹材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)氧化石墨烯-血晶素复合物在滤纸材料表面的固定(1-1)运用负压将氧化石墨烯-血晶素复合物固定在滤纸材料表面；(2)纸基双印迹材料的制备(2-1)将功能单体丙烯酰胺、模板蛋白质和模板3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶解在磷酸盐缓冲溶液中，充分混匀后，20℃-37℃孵育10min-30min；(2-2)将步骤(1-1)制备得到的表面固载有氧化石墨烯-血晶素复合物的滤纸材料加入到步骤(2-1)所得的溶液中，加入交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，并加入过氧化氢和乙酰丙酮，在20℃-37℃下避光聚合12h-24h；(2-3)将步骤(2-2)所得滤纸材料用洗脱液洗去模板蛋白质和模板3,3',5,5'-四甲基联苯胺后，得到选择性识别模板蛋白质和模板3,3',5,5'-四甲基联苯胺的纸基双印迹材料。2.如权利要求1所述的选择性识别蛋白质的纸基双印迹材料的制备方法，其特征在于，步骤(2-1)中所述的功能单体丙烯酰胺用于提供乙烯双键、氨基和酰胺基团与模板蛋白质和模板3,3',5,5'-四甲基联苯胺聚合反应，形成模板蛋白质和模板3,3',5,5'-四甲基联苯胺的空间立体结构。3.如权利要求1所述的选择性识别蛋白质的纸基双印迹材料的制备方法，其特征在于，步骤(2-1)中的功能单体丙烯酰胺在氧化石墨烯-血晶素复合物和过氧化氢以及乙酰丙酮的引发作用下，发生乙烯双键的断裂加成反应，并在交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的作用下，交联形成多聚物。4.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：荆涛，汪秀，黄凯，梅素容，周宜开，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42