口服活性受体激活剂治疗肥胖相关疾病方法与系统技术方案

本研究不同于以往的其它研究，应用生物学方法探讨AdipoRon对2型糖尿病治疗的作用机制。以肝脏细胞作为实验对象，构建阻断P13/Akt信号通路的实验组，再给予AdipoRon作用，分析肝细胞相关糖类基因表达，探讨AdipoRon对2型糖尿病治疗的细胞机制。目前，本项研究国内外尚未见报道。因为当前治疗2型糖尿病的方法几乎都需要合理饮食和锻炼，并且产生低血糖和体重增加等不良影响，而口服AdipoRon可安全地减少多余的热量摄入并减轻久坐不动的生活方式所带来的后果，所以AdipoRon提供了一个新颖的治疗方法。用此方法可节省许多购买db/db小鼠和双基因敲除小鼠的经费问题。

【技术实现步骤摘要】
口服活性受体激活剂治疗肥胖相关疾病方法与系统
口服活性受体激动剂对肥胖相关疾病(如II型糖尿病)治疗领域，尤其涉及验证AdipoRon(一种脂联素受体活性激活剂)对II型糖尿病治疗的可行性。
技术介绍
研究显示，糖尿病已经成为一种严重威胁人类健康的内分泌代谢性疾病。在糖尿病患者中，II型糖尿病占95％以上。II型糖尿病患者发生结直肠癌、肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤的风险显著高于一般人群。胰岛素耐受是导致一种肥胖和易患个体患病如II型糖尿病和心血管疾病的常见原因。目前，II型糖尿病治疗药物主要以口服降糖药为主，但常伴有一些严重的不良反应，如低血糖、消化道反应、增加心脏病风险等。现研究发现，脂联素是一种抗糖尿病和抗动脉粥样硬化的内源性生物多肽或蛋白质。在肥胖、胰岛素抵抗和II型糖尿病病人体内，血浆脂联素水平有所降低。减轻脂联素降低对机体的影响有两种方法：一是提高脂联素本身水平，如通过注射脂联素；二是激活脂联素受体。然而，脂联素注入有一定困难，如需要脂联素拥有非常高的血浆浓度和以及最高的活动形式--高分子重量脂联素多聚体。已发现脂联素受体激动剂对脂联素受体的影响，如使胰岛素敏感性和葡萄糖耐量增加，以及抑制心血管疾病和癌症。日本东京大学研究人员发现一种化合物能够与脂联素受体结合在一起，并通过动物实验证实它与脂联素有类似功效，他们将这种化合物命名为AdipoRon，是脂联素受体激动剂。与介导脂肪细胞因子的抗糖尿病作用的AdipoR1和AdipoR2受体结合，并激活这两个受体。AdipoR1和AdipoR2受体在葡萄糖调节和脂类代谢、炎症和体内氧化应激中起重要作用角色。因此，口服活性AdipoR1和AdipoR2小分子受体激动剂的一直是主要研究方向。验证口服活性AdipoR1和AdipoR2小分子受体激动剂的效果及作用机制，将成为替代有诸多不良反应的口服降糖药的重要途径。对口服型活性激活剂的新药开发、临床治疗、临床推广方面有着重要的现实意义。目前，国内外证实口服活性AdipoR1和AdipoR2小分子受体激动剂的效果及作用机制是采用野生型、Adipor1-/-、Adipor2-/-、Adipor1-/-Adipor2-/-双敲除小鼠和db/db小鼠做对照实验，通过检测各传导通路活性、相关基因检测，验证AdipoRon对II型糖尿病的改善作用。口服AdipoRon，显著降低了甘油三酸酯含量和氧化应激，减少编码促炎细胞因子基因的表达水平。其中Adipor1-/-、Adipor2-/-、Adipor1-/-Adipor2-/-双敲除小鼠和db/db小鼠来源少、价格昂贵，不适实合实验室推广。
技术实现思路
为了克服Adipor1-/-、Adipor2-/-、Adipor1-/-Adipor2-/-双敲除小鼠和db/db小鼠动物模型难以实现问题，本技术提前构建II型糖尿病小鼠模型，进一步对小鼠进行各项指标检测。组织学水平，对比观察普通小鼠对照组(NC)、II型糖尿病小鼠组(DM)、给低剂量AdipoRon小鼠组(DM+L)、给高剂量AdipoRon小鼠组(DM+H)的组织特征；细胞水平，AdipoRon改善C2C12细胞胰岛素敏感性；分子水平，对各组小鼠血清中相关指标进行生化检测，重点监测肝脏中各项相应指标含量，测定各组小鼠血胰岛素含量；基因水平，检测肝脏中糖代谢相关酶PEPCKmRNA，C2C12细胞中GLUT4mRNA表达的测定；综合检测AdipoRon对PI3K/Akt信号通路影响。本技术通过构建II型糖尿病小鼠模型克服了β细胞基因敲除小鼠的高成本问题，简化了验证口服活性激活剂对肥胖相关疾病(如II型糖尿病)治疗效果实验。为口服活性激活剂疗效的验证性实验提供一种新型、简便的方法与系统，一定程度上推动口服活性激活剂新药开发和临床治疗的进展，具有良好的推广性和可行性。具体实施方式1.II型糖尿病小鼠模型的制备及分组处理使用12周大的雄性C57BL/6小鼠40只(购自中国科学院上海实验动物中心)，40只SPF级雄性C57/BL6小鼠(适应性喂养1周，随机分为正常对照NC组10只和实验组30只，NC组给予常规饲料，实验组给予高糖高脂饮食(常规饲料66.5％+20％红糖+10％猪油+2.5％胆固醇+1％胆酸盐)喂养。5周后，禁食12h，腹腔注射1％链脲佐菌素40mg/kg诱导糖尿病模型，72h后禁食4h，断尾取血测FPG。血糖浓度＞11mmol/L，且出现多饮、多食、多尿症状提示糖尿病鼠模型诱导成功。每日一次处理：DM+L组小鼠灌胃AdipoRon，剂量为1.25mg/kg；DM+H组小鼠灌胃AdipoRon，剂量为6.25mg/kg；将AdipoRon溶于去离子水，NC，DM组灌胃等量去离子水。干预10d后，禁食4h，断尾取血测空腹血糖。摘眼球取血0.6ml，分离上清于干净的离心管中，保存于-4℃。取各组肝脏标本并编号，部分4％多聚甲醛固定，部分保存于-80℃。2.组织学检查：将给药AdipoRon分低剂量(DM+L)、高剂量组(DM+H)、II型糖尿病组(DM)、普通对照组(NC)的肝脏标本经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，制成6μm厚的切片，用苏木精和伊红染色；用OLYMPUSCX31电子显微镜观察，SONY彩色数码摄像头(EXWAVEHADDIGITAL)摄像，图片经PAS9000病理图像分析系统处理，观察肝脏组织形态变化。HE染色察并比较各组胰岛素的主要效用器官-肝脏的组织形态。3.用全自动生化仪检测相关指标：(1)血清中各组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及碱性磷酸酶(ALP)的指标。(2)血清中各组甘油三酯(TG)、血糖(GLU)的变化，用ELISA试剂盒检测胰岛素(INS)和游离脂肪酸(FFA)含量的测定4.肝脏中SOD、CAT、MDA、NOS、G6PC的含量测定取肝脏用0.2M磷酸盐缓冲液制成5％肝匀浆，检测肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)及一氧化碳合酶(NOS)、葡萄糖-6磷酸酶(G6PC)含量5.肝脏中糖代谢相关酶PEPCKmRNA含量测定采用Trizol一步法提取小鼠肝组织总RNA，逆转录合成cDNA，操作遵照试剂盒说明书，用实时荧光定量PCR测定肝磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)mRNA表达，以β-actin为内参。PEPCK上游引物：5’-TGAAAGGCCGCACCATGTAT-3’；PEPCK下游引物：5’-GCACAGATATGCCCATCCGA-3’。β-actin上游引物：5’-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3’；β-actin下游引物：5’-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3’。反应体系20μl：SYBRGreen(2×)10μl，10μmol/L上下游引物各0.4μl，ddH2O7.2μl，模板0.2μl。反应条件：95℃变性30s；循环40次：95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸34s；融解：95℃15s，60℃1min，95℃15s；冷却：60℃15s。6.AdipoRon改善C2C12细胞胰岛素敏感性的测定(1)C2C12的培养：加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型的小鼠实验方式，克服Adipor1‑/‑、Adipor2‑/‑、Adipor1‑/‑Adipor2‑/‑双敲除小鼠和db/db小鼠动物模型难以实现的问题。

【技术特征摘要】
1.一种新型的小鼠实验方式，克服Adipor1-/-、Adipor2-/-、Adipor1-/-Adipor2-/-双敲除小鼠和db/db小鼠动物模型难以实现的问题。2.根据权利要求1所述的新型小鼠实验方式，其特征是在证实口服活性AdipoR1和AdipoR2小分子受体激动剂的效果及作用机制的实验中，提前构建II型糖尿病小鼠模型，进一步对小鼠进行各项指标检测。3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖敏，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33