一种重组人源胶原蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人源胶原蛋白的纯化方法，先采用固液分离技术、过滤技术以及超滤技术对大批量的重组人源胶原蛋白进行粗纯，然后用离子交换层析技术进行精纯，所得目标蛋白纯度大于98％，收率大于70％。本发明专利技术工艺过程更简单、易操作，对纯化成本要求低，可满足重组人源胶原蛋白工业化生产要求。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人源胶原蛋白的纯化方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种重组人源胶原蛋白的分离纯化方法。
技术介绍
胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的25％～33％，可作为食品添加剂、絮凝剂、乳胶材料、固定化酶载体材料。胶原蛋白是由平行线型链组成，每一线型链由三条扭曲左旋的α-肽链通过链间相互作用紧密结合而形成的一极强的右旋三重螺旋结构。每条α-肽链由多达300个以上的Gly-X-Y三联体重复构成，两端连接具有不同结构的其它小片段。在现有技术中，生产胶原蛋白传统的也是最主要的方法是利用酸、碱法处理动物来源的组织，为提高胶原蛋白的生物安全性、纯度及活性，拓宽其在化妆品和医疗器械等领域的应用。基因工程技术被广泛应用。国内外一些研究机构及生物公司相继投入研究开发重组人源胶原蛋白，西北大学的范代娣等利用大肠杆菌通过高密度发酵培养生产类人胶原蛋白。中国专利201110327865公开了一种重组人源胶原蛋白及其制备方法，构建了毕赤酵母重组人缘胶原蛋白的基因工程菌，获得了重组人源胶原蛋白。这两种方法都实现了产业化，但在生产过程中，主要的生产成本和工艺难点都在分离纯化阶段。大肠杆菌需要进行菌体收集及破壁，到最后的蛋白复性，毕赤酵母重组人源胶原蛋白分离纯化过程中的发酵液脱色，纯化过程蛋白稳定性等均存在问题。
技术实现思路
本专利技术针对现有重组人源胶原蛋白生产存在的问题，提供一种操作简单，所需溶剂少，纯化成本低廉，适合规模化重组人源胶原蛋白纯化的方法。解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：1、粗分离将重组人源胶原蛋白发酵液用沉降式离心机进行固液分离，所得上清液用0.2μm中空纤维膜进行过滤，滤出液用截留分子量为6K的超滤膜进行超滤。2、精细分离纯化向步骤1超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.1～5.8mS/cm，再用NaOH调节pH至4.5～6.0，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相A与流动相B体积比为95:5的混合液洗脱，最后用流动相A与流动相B体积比为90:10～70:30的混合液洗脱，洗脱流速均为150～250L/min；收集流动相A与流动相B体积比为90:10～70:30时的洗脱液，得到纯度大于98％的重组人源胶原蛋白，其中所述的流动相A是20～50mmol/LpH＝4.5～6.0的柠檬酸缓冲液；流动相B是含1mol/LNaCl的20～50mmol/LpH＝4.5～6.0的柠檬酸缓冲液。本专利技术重组人源胶原蛋白的氨基酸数量为411个，分子量为37.2KDa，PI为8.9～9.2，氨基酸序列如下所示：GPPGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKPGSPGPPGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKPGTPGPPGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKP。上述步骤1中，优选所得上清液用0.2μm中空纤维膜进行过滤过程中，压力不得高于0.15MPa。上述步骤1中，进一步优选所述截留分子量为6K的超滤膜为中空纤维超滤膜，且超滤过程中控制超滤膜压力不高于0.05MPa。上述步骤2中，优选所述弱阳离子交换层析柱的填料为高流速琼脂糖弱阳离子交换填料，填料总离子交换量不低于0.06mmol/mL，线性流速不得高于10mL/cm，进一步优选所述高流速琼脂糖弱阳离子交换填料的粒径为45～150μm。本专利技术纯化方法中离心、过滤技术均为成熟工艺，操作简单，成本低，适合大规模生产；采用6K超滤膜对滤出液进行超滤、浓缩、脱盐，此过程还可除去一些小分子物质，效率相比传统的凝胶层析脱盐，除小分子物质效率高，易操作；最后进行一步离子交换层析，得到的重组人源胶原蛋白纯度在98％以上，收率高达70％以上。本专利技术整个纯化工艺简单，工艺稳定，成本低廉，是一种理想的大规模重组人源胶原的纯化方法。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术的保护范围并不仅限于这些实施例。下面实施例中含有重组人源胶原蛋白的毕赤酵母发酵液的制备方法为：将设计并人工合成的重组人源胶原蛋白核苷酸序列(GGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGATCCCCGGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGTACCCCAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：(1)粗分离将重组人源胶原蛋白发酵液用沉降式离心机进行固液分离，所得上清液用0.2μm中空纤维膜进行过滤，滤出液用截留分子量为6K的超滤膜进行超滤；(2)精细分离纯化向步骤(1)超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.1～5.8mS/cm，再用NaOH调节pH至4.5～6.0，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相A与流动相B体积比为95:5的混合液洗脱，最后用流动相A与流动相B体积比为90:10～70:30的混合液洗脱，洗脱流速均为150～250L/min；收集流动相A与流动相B体积比为90:10～70:30时的洗脱液，得到纯度大于98％的重组人源胶原蛋白；上述的流动相A是20～50mmol/L pH＝4.5～6.0的柠檬酸缓冲液；流动相B是含1mol/L NaCl的20～50mmol/L pH＝4.5～6.0的柠檬酸缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种重组人源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：(1)粗分离将重组人源胶原蛋白发酵液用沉降式离心机进行固液分离，所得上清液用0.2μm中空纤维膜进行过滤，滤出液用截留分子量为6K的超滤膜进行超滤；(2)精细分离纯化向步骤(1)超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.1～5.8mS/cm，再用NaOH调节pH至4.5～6.0，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相A与流动相B体积比为95:5的混合液洗脱，最后用流动相A与流动相B体积比为90:10～70:30的混合液洗脱，洗脱流速均为150～250L/min；收集流动相A与流动相B体积比为90:10～70:30时的洗脱液，得到纯度大于98％的重组人源胶原蛋白；上述的流动相A是20～50mmol/LpH＝4.5～6.0的柠檬酸缓冲液；流动相B是含1mol/LNaCl的20～50mmol/LpH＝4.5～6.0的柠檬酸缓冲液。2.根据权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述的重组人源胶原蛋白的氨基酸数量为411个，分子量为37.2KDa，PI为8.9～9.2，氨基酸序列如下所示：GPPGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKG...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓晗，史瑾，郝东，王维，王俊，赵金礼，杨小琳，
申请(专利权)人：陕西慧康生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61