一个靶向镉离子的金属结合肽Z4及其应用制造技术

本发明专利技术属于废水处理技术领域，具体涉及一个靶向镉离子的金属结合肽Z4及其应用的专利申请。金属结合肽序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：GLHTWATNLYSM。本发明专利技术利用随机噬菌体十二肽库的筛选技术，得到了能与镉离子具有高亲和力的特异性结合的十二肽，进一步将该结合肽编码基因整合进入酿酒酵母后，利用酿酒酵母凝集素表面展示系统EBY100，将具有特异吸附镉离子的金属结合肽展示在其细胞壁的外表面，从而可以作为吸附剂加以应用。初步试验表明：每克湿菌体能够吸附257毫克的镉离子，每克干菌体能够吸附约2500‑3000毫克镉离子，表现出良好的应用效果，具备了一定的产业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一个靶向镉离子的金属结合肽Z4及其应用
本专利技术属于废水处理
，具体涉及一个靶向镉离子的金属结合肽Z4及其应用的专利申请。
技术介绍
在所有危害人类健康的剧毒物质中，美国毒物管理的委员会（ATSDR）把镉列在了第六位。由于隔对动物和人类具有致癌性，因此在环境污染治理中，如何消除包括镉在内的重金属水污染是令人头疼的世界性的难题。传统的含镉废水处理工艺主要包括化学沉淀法（氢氧化物或硫化物）、离子交换法、铁氧体电解法、蒸发浓缩法和膜分离法等。但这些方法存在投资大、运行费用高、有局限性、工艺复杂、费用昂贵、产生二次污染等缺点，因此寻求高效、低廉、方便、环保的含镉废水处理技术已成为全世界化学、环境和生物学家共同努力的目标。随着基因工程技术的出现，传统的微生物遗传育种方法被打破。研究发现，在各种动植物和微生物细胞内存在着对金属离子具有亲和力的蛋白质（肽），称为金属结合蛋白（肽），这种蛋白可与环境中的各种金属离子结合从而降低或消除对生物细胞的毒性。但进一步研究发现该技术也存在着局限性，主要原因是外源肽在细胞质内表达不稳定，半衰期短，容易被受体菌内蛋白酶水解，限制其在工业化中的应用。但由于该方法良好的生态环保性，因而仍是研究热点，也因此，寻找新的适于工业化应用的金属结合肽及生物处理废水方法，具有十分重要的应用意义。
技术实现思路
本申请主要目的是提供一个靶向镉离子的金属结合肽，利用该结合肽可制备微生物细胞表面吸附剂，从而可以实现对废水中镉离子的有效吸收和降解。本申请所采取的技术方案详述如下。一个靶向镉离子的金属结合肽Z1，包含12个氨基酸，多肽序列如SEQIDNO.1所示，具体为：MHPNAGHGSLMR；所述靶向镉离子的金属结合肽Z1的编码碱基，包括36个碱基，碱基序列如SEQIDNO.2所示，具体为：ATGCATCCGAATGCGGGGCATGGTTCGCTTATGCGG。一个靶向镉离子的金属结合肽Z2，包含12个氨基酸，多肽序列如SEQIDNO.3所示，具体为：ADWYHWRSHSSS；所述靶向镉离子的金属结合肽Z2的编码碱基，包括36个碱基，碱基序列如SEQIDNO.4所示，具体为：GCTGATTGGTATCATTGGAGGTCTCATAGTAGTTCT。一个靶向镉离子的金属结合肽Z3，包含12个氨基酸，多肽序列如SEQIDNO.5所示，具体为：DYNYDRSDSRLT；所述靶向镉离子的金属结合肽Z3的编码碱基，包括36个碱基，碱基序列如SEQIDNO.6所示，具体为：GATTATAATTATGATCGTTCGGATAGTGGTCTTACT。一个靶向镉离子的金属结合肽Z4，包含12个氨基酸，多肽序列如SEQIDNO.7所示，具体为：GLHTWATNLYSM；所述靶向镉离子的金属结合肽Z3的编码碱基，包括36个碱基，碱基序列如SEQIDNO.8所示，具体为：GGTTTGCATACTTCGGCTACTAATCTGTATTCGATG。所述靶向镉离子的金属结合肽（Z1、Z2、Z3、Z4）在废水处理中的应用，可以靶向结合镉离子。利用所述靶向镉离子的金属结合肽（Z1、Z2、Z3、Z4）编码碱基所构建的重组质粒（pYD1-Z1、pYD1-Z2、pYD1-Z3、pYD1-Z4）。利用所述靶向镉离子的金属结合肽所制备的微生物吸附剂，通过将靶向镉离子的金属结合肽的编码碱基整合进入酿酒酵母基因组中制备获得；具体而言，将重组质粒pYD1-Z1、pYD1-Z2、pYD1-Z3、pYD1-Z4转化酿酒酵母后，进一步筛选、鉴定获得转基因酿酒酵母。所述靶向镉离子的金属结合肽所制备的微生物吸附剂，为液体形态或固体形态，所述固体形态的微生物吸附剂，通过如下步骤制备获得：（1）将含有金属结合肽编码碱基的酿酒酵母置于YPD培养基中，30℃、200rpm摇菌培养至OD600约为0.6；（2）将步骤（1）中菌液离心收集菌体后，将菌体转移至诱导培养基YNB-CAA培养基内，30℃、200rpm过夜摇动培养，离心收集菌体，将菌体溶于无菌的蒸馏水中，将配置好的海藻酸钠包埋载体和蒸馏水重悬的酿酒酵母菌液混合均匀；将混合好的液体以相同的速度滴加到无菌的氯化钙溶液中，造粒，20℃静止放置24h；（3）用无菌水对步骤（2）中造粒后固体（即固定化后细胞）清洗不少于三次，4℃放置保存备用即可。固定化后酿酒酵母，呈颗粒状，观察表明：颗粒大小均匀、形状一致，直径在3-5mm之间，且韧性较好，不易破裂。应用时，将固定化后转基因酿酒酵母置于含有镉离子的诱导培养基YNB-CAA中进行培养吸附即可。微生物蛋白展示技术和基因工程技术的结合为水污染处理提供了一种新的解决途径。微生物展示技术是将编码目的肽（广义地包括多肽和蛋白）)的DNA片段通过基因重组的方法构建和表达在噬菌体外壳蛋白、细菌（外膜蛋白、菌毛及鞭毛）或酵母（糖蛋白）等微生物的表面，利用宿主细胞内蛋白转运系统将外源目的肽运送并锚定在外膜表面，可以有效实现结合肽在细胞表面的固定，由于这种细胞对金属离子的吸附主要源于细胞表面的金属结合肽，因此我们将其称为细胞表面吸附剂。本专利技术利用随机噬菌体十二肽库的筛选技术，得到了能与镉离子具有高亲和力的特异性结合的十二肽，进一步将该结合肽编码基因整合进入酿酒酵母后，利用酿酒酵母凝集素表面展示系统EBY100，将具有特异吸附镉离子的金属结合肽展示在其细胞壁的外表面，从而可以作为吸附剂加以应用。初步试验表明：该细胞表面吸附剂对含镉量为7000mg/L的高浓度废水，每克湿菌体能够吸附257毫克的镉离子，每克干菌体能够吸附约2500-3000毫克镉离子。对含镉量为500mg/L及其该浓度以下的废水达到了100%的吸收率，表现出良好的应用效果，具备了一定的产业化应用前景。附图说明：图1为重组大肠杆菌116的单酶切验证结果，其中，M代表DNAMarker，1代表pYD1空质粒，2代表pYD1-Z1片段，3代表pYD1-Z2片段，4代表pYD1-Z3片段，5代表pYD1-Z4片段；图2为重组大肠杆菌116的PCR验证结果，其中M代表DNAMarker，1代表Z1PCR片段，2代表Z2PCR片段，3代表Z3PCR片段，4代表Z4PCR片段；图3为重组酿酒酵母验证结果；图4为镉离子标准曲线。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂等背景情况简要介绍说明如下。生物材料：大肠杆菌（Escherichiacoli）2738，购自NEB公司，是M13噬菌体可以侵染的一种宿主菌，它是一种强F+菌株，该菌具有四环素抗性；随机的十二肽噬菌体展示文库（phagedisplay-12），购自NEB公司，该文库是将随机排列的十二个肽序列，整合至M13丝状噬菌体的表面衣壳蛋白上；大肠杆菌（E.coli）116菌株，购自Epicentre公司；酿酒酵母EBY100，是一种毕赤酵母菌株，属于真核细胞，为一种色氨酸的缺陷型的菌株，只能在YPD培养基中生长；购于北京中科质检生物技术有限公司；pMDTVector，该质粒为T克隆载体，用于TA克隆，具有氨苄青霉素（Ampicillin）抗性基因片段，从Takara公司购得；pYD1质粒：该质粒用于与目的片段本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个靶向镉离子的金属结合肽Z4，其特征在于，包含12个氨基酸，多肽序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：GLHTWATNLYSM。

【技术特征摘要】
1.一个靶向镉离子的金属结合肽Z4，其特征在于，包含12个氨基酸，多肽序列如SEQIDNO.7所示，具体为：GLHTWATNLYSM。2.权利要求1所述靶向镉离子的金属结合肽Z4编码碱基，其特征在于，包括36个碱基，碱基序列如SEQIDNO.8所示，具体为：GGTTTGCATACTTCGGCTACTAATCTGTATTCGATG。3.权利要求1所述靶向镉离子的金属结合肽Z4在废水处理中的应用，其特征在于，靶向结合镉离子。4.利用权利要求2所述靶向镉离子的金属结合肽Z4编码碱基所构建的重组质粒pYD1-Z4。5.利用权利要求2所述靶向镉离子的金属结合肽所制备的微生物吸附剂，其特征在于，通过将靶向镉离子的金属结...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海燕，王刚，何艳霞，曹晓婉，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南,41