基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于石墨烯材料的L‑赖氨酸电化学传感器及其制备方法，所述制备方法是以L‑赖氨酸氧化酶修饰玻碳电极，并以石墨烯纳米材料为增敏材料，将修饰后的玻碳电极作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、铂电极作为辅助电极，分别设置在电解池中形成三电极体系，制得L‑赖氨酸电化学传感器。本发明专利技术还涉及所述基于石墨烯材料的L‑赖氨酸电化学传感器在检测食品或药品中L‑赖氨酸中的应用。本发明专利技术的基于石墨烯材料的L‑赖氨酸电化学传感器具有检测简单快速、灵敏度高、成本低的优点，可实现对L‑赖氨酸的高选择性识别检测的目的。

【技术实现步骤摘要】
基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器及其制备方法
本专利技术涉及电化学传感器
，特别是涉及一种基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
氨基酸检测在食品加工、营养分析、医药检测、医疗诊断以及科学研究等领域具有重大意义。现有的茶叶或果蔬中的氨基酸检测大多采用色谱或氨基酸自动分析仪进行检测，例如：研究者应用衍生试剂N-(特丁基二甲基硅烷)-N-甲基三氟乙酰胺衍生、气相色谱和气相质谱联用仪测定茶叶中的游离氨基酸；或采用日立L-8800型氨基酸自动分析仪分析金花茶及显脉金花茶成熟植株叶片中氨基酸类成分；也有研究者利用氨基酸分析仪测定5个杨桃品种果实中17种氨基酸含量，为杨桃的良种选育提供依据。单一种类天然氨基酸选择性识别检测对于食品、医疗及科研等方面同样意义重大。然而，由于氨基酸结构相似、光谱惰性、弱载色体以及不具电化学活性等因素，给检测带来很大的挑战。现有大多数方法均为对茶叶、果蔬中多种甚至十余种氨基酸的同步检测，检测时间长，分析过程复杂，在单一氨基酸选择性识别检测方面遭遇瓶颈。因此，发展新的、简单快速、灵敏度高、可实现单一天然氨基酸识别检测的检测技术或方法十分重要。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于，提供一种基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器的制备方法，制得的L-赖氨酸电化学传感器具有检测简单快速、灵敏度高、成本低的优点，可实现对L-赖氨酸的高选择性识别检测的目的。本专利技术采用的技术方案如下：一种基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)取石墨烯纳米材料分散于溶剂中，制成分散液备用；(2)取L-赖氨酸氧化酶，在搅拌下加入磷酸缓冲液，得到混合液静置备用；(3)取玻碳电极进行打磨和清洗；(4)取步骤(2)所得混合液中的上层酶溶液加入到含有成膜剂的水溶液中，然后加入牛血清蛋白、辣根过氧化酶、步骤(1)所得分散液以及戊二醛溶液，搅拌均匀后，滴在步骤(3)所得的玻碳电极表面，再将玻碳电极冷冻干燥使其表面成膜，然后将所得修饰后的玻碳电极冰冻保存；(5)取步骤(4)修饰后的玻碳电极作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、铂电极作为辅助电极，分别设置在电解池中形成三电极体系，制得基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器。本专利技术采用滴涂法将L-赖氨酸氧化酶、石墨烯纳米材料、成膜剂、牛血清蛋白、辣根过氧化酶、戊二醛复合成生物敏感膜以修饰玻碳电极，其中，L-赖氨酸氧化酶作为生物活性物质，能催化样品中的目标物L-赖氨酸发生氧化反应，并借助玻碳电极将化学反应信号变换为可测量的电信号；石墨烯纳米材料作为增敏材料，其比表面积大、导电性能好，能够加速酶活性中心与电极之间的直接电子传递，提高传感器的灵敏度和响应速度；成膜剂能够使制成的生物敏感膜获得强附着力；牛血清蛋白(BSA)作为封闭剂，起到对玻碳电极表面活性位点进行封闭的作用；辣根过氧化酶(horseradishperoxide,HRP)可以促进电子的传递、催化反应的进行；戊二醛作为交联剂，起到材料之间的交联作用。而且，本专利技术通过合理设计材料处理和电极修饰等各个步骤，保证了电化学传感器的稳定性和再现性。本专利技术将修饰后的玻碳电极作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、铂电极作为辅助电极，通过三电极体系构建L-赖氨酸电化学传感器，实现了对不同样品中L-赖氨酸的选择性识别检测。相对于现有氨基酸自动分析仪对十余种氨基酸的同步检测方式，本专利技术由于选用了L-赖氨酸氧化酶对工作电极进行修饰，所以该电化学传感器只对L-赖氨酸产生电化学相应信号，而对其他类别氨基酸均无响应，实现了选择性识别检测样品溶液中L-赖氨酸的目的，且检测操作更为简便快速、灵敏度更高、成本也更低。本专利技术的基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器可适用于茶、油茶、蜜柚等不同果蔬、不同天然药物中L-赖氨酸活性成分的选择性检测，为食品加工、营养分析、医药检测等工作提供样品中L-赖氨酸的含量信息。进一步地，所述L-赖氨酸氧化酶是由莱茵海默氏菌(Rheinheimerasp.，购于SigmaAldrich公司))、被囊假交替单胞菌(Pseudoalteromonastunicata，购于Amresco公司)、绿色木霉菌(richodermaviride，购于SigmaAldrich公司)中的任意一种生产所得，或者是从长白山蝮蛇蛇毒、鲐鲅鱼黏液(MucusofScomberjaponicus)中的任意一种分离提纯所得。其中，最优的选择为由莱茵海默氏菌(Rheinheimerasp.)生产的L-赖氨酸氧化酶或者从鲐鲅鱼黏液(MucusofScomberjaponicus)分离提纯所得的L-赖氨酸氧化酶，经实验发现，这两种氧化酶对L-赖氨酸的选择性更加显著，而对其他类别氨基酸信号的抗干扰能力更强。进一步地，所述石墨烯纳米材料为氨基修饰二茂铁/石墨烯氧化物纳米复合材料、氧化锡/石墨烯纳米复合材料、二氧化钛/石墨烯纳米复合材料、三氧化二铟立方体/石墨烯纳米复合材料、石墨烯纳米纤维、氟化石墨烯、氮掺杂石墨烯、硼掺杂石墨烯、石墨烯量子点中的任意一种或多种。进一步地，步骤(1)为：取石墨烯纳米材料分散于N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，超声分散20分钟，制成石墨烯纳米材料浓度为1mg/ml的分散液备用。进一步地，步骤(2)中，L-赖氨酸氧化酶与磷酸缓冲液的用量比例为1mg:(3.8～3.9)μl；所述磷酸缓冲液的pH值为7.2～7.4。进一步地，步骤(3)为：取一支玻碳电极，依次用4#、5#、6#的金相砂纸打磨，然后先后在1μm和0.3μm的氧化铝粉末上抛光，再将其放入丙酮中浸泡，取出后依次在乙醇和二次蒸馏水中超声洗涤各5分钟，再在浓度为1.0mM的铁氰化钾(K3Fe(CN)6)溶液中采用循环伏安法对该玻碳电极进行处理，处理后取出用二次蒸馏水清洗，然后自然干燥备用。进一步地，步骤(4)为：取步骤(2)所得混合液中的上层酶溶液25μl加入到45μl质量浓度为1-2％的成膜剂水溶液中，然后加入1.8mg牛血清蛋白、1mg辣根过氧化酶、10μl步骤(1)所得分散液以及10μl质量浓度为12.5％的戊二醛溶液，搅拌均匀后，滴在步骤(3)所得的玻碳电极表面，再将玻碳电极冷冻干燥使其表面成膜，然后将所得修饰后的玻碳电极冰冻保存。成膜剂用量过多会导致形成生物敏感膜太厚，太少也会导致膜不完整，影响传感器的灵敏度。牛血清蛋白、辣根过氧化酶用量太多会干扰到最终L-氨基酸检测的灵敏度及选择性，太少则起不到封闭或促进电子传导的效果。戊二醛起到原料间的交联作用，如果用量太少，会导致交联不彻底，用量太多则团聚明显，使形成的生物敏感膜的灵敏度大打折扣。进一步地，步骤(5)中，所述电解池的规格为10ml，其装有2mlpH值为7～8的磷酸缓冲液作为测试底液。本专利技术还提供上述任一项所述的制备方法制得的基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器。本专利技术还提供上述基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器在检测食品或药品中L-赖氨酸中的应用，特别是在检测茶、金花茶、蜜柚等食品、药材及果蔬中L-赖氨酸中的应用。为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本专利技术。附图说明图1为实施例1制备基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器的流程示意图；图中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于石墨烯材料的L‑赖氨酸电化学传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取石墨烯纳米材料分散于溶剂中，制成分散液备用；(2)取L‑赖氨酸氧化酶，在搅拌下加入磷酸缓冲液，得到混合液静置备用；(3)取玻碳电极进行打磨和清洗；(4)取步骤(2)所得混合液中的上层酶溶液加入到含有成膜剂的水溶液中，然后加入牛血清蛋白、辣根过氧化酶、步骤(1)所得分散液以及戊二醛溶液，搅拌均匀后，滴在步骤(3)所得的玻碳电极表面，再将玻碳电极冷冻干燥使其表面成膜，然后将所得修饰后的玻碳电极冰冻保存；(5)取步骤(4)修饰后的玻碳电极作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、铂电极作为辅助电极，分别设置在电解池中形成三电极体系，制得基于石墨烯材料的L‑赖氨酸电化学传感器。

【技术特征摘要】
1.一种基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取石墨烯纳米材料分散于溶剂中，制成分散液备用；(2)取L-赖氨酸氧化酶，在搅拌下加入磷酸缓冲液，得到混合液静置备用；(3)取玻碳电极进行打磨和清洗；(4)取步骤(2)所得混合液中的上层酶溶液加入到含有成膜剂的水溶液中，然后加入牛血清蛋白、辣根过氧化酶、步骤(1)所得分散液以及戊二醛溶液，搅拌均匀后，滴在步骤(3)所得的玻碳电极表面，再将玻碳电极冷冻干燥使其表面成膜，然后将所得修饰后的玻碳电极冰冻保存；(5)取步骤(4)修饰后的玻碳电极作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、铂电极作为辅助电极，分别设置在电解池中形成三电极体系，制得基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器。2.根据权利要求1所述的基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述L-赖氨酸氧化酶是由莱茵海默氏菌、被囊假交替单胞菌、绿色木霉菌中的任意一种生产所得，或者是从长白山蝮蛇蛇毒、鲐鲅鱼黏液中的任意一种分离提纯所得。3.根据权利要求1所述的基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述石墨烯纳米材料为氨基修饰二茂铁/石墨烯氧化物纳米复合材料、氧化锡/石墨烯纳米复合材料、二氧化钛/石墨烯纳米复合材料、三氧化二铟立方体/石墨烯纳米复合材料、石墨烯纳米纤维、氟化石墨烯、氮掺杂石墨烯、硼掺杂石墨烯、石墨烯量子点中的任意一种或多种。4.根据权利要求1-3任一项所述的基于石墨烯材料的L-赖氨酸电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)为：取石墨烯纳米材料分散于N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，超声分散20分钟，制成石墨烯纳米材料...

【专利技术属性】
技术研发人员：程金生，
申请(专利权)人：韶关学院，
类型：发明
国别省市：广东,44