一种检测啶虫脒的电化学传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种检测啶虫脒的电化学传感器及其制备方法，所述的电化学传感器包括检测电极和匹配试剂；所述检测电极包括金电极和由内至外依次包裹在所述金电极外的DHLA活化层、啶虫脒抗体层和MCH封闭层；所述匹配试剂包括啶虫脒半抗原探针溶液和亚甲基蓝探针溶液。本发明专利技术所述的电化学传感器实现了小分子的免疫检测，检测速度快；检出限为3.2ng L

【技术实现步骤摘要】
一种检测啶虫脒的电化学传感器及其制备方法和应用
本专利技术涉及电化学传感器
，尤其涉及一种检测啶虫脒的电化学传感器及其制备方法。
技术介绍
新型杀虫剂啶虫脒属于硝基亚甲基杂环类化合物，可作用于昆虫神经系统突触部位的烟碱乙酰胆碱受体，干扰昆虫神经系统的刺激传导，引起神经系统通路阻塞，造成神经递质乙酰胆碱在突触部位的积累，从而导致昆虫麻痹，最终死亡。啶虫脒已取代常规杀虫剂如有机磷、氨基甲酸酯等在全球范围内广泛应用。啶虫脒与众多其他农药类似，在应用的过程中不可避免地存在残留，而由于农药残留引起的食品安全问题已成为全世界公众关注的焦点。对于啶虫脒的检测，传统的方法包括高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、质谱(MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)。这些方法虽具有灵敏度高，稳定性好，重复性好的优点，但在实际检测过程中往往需要进行复杂的样品前处理、昂贵的检测仪器和试剂，并且对检测人员的专业水准也有较高的要求。因此，迫切需要开发简单、快速、高灵敏的有效分析方法来检测啶虫脒。免疫分析技术是基于抗原抗体的特异性识别作用进行测定，灵敏度高，特异性好，但基于免疫技术的研究多集中在DNA、蛋白质、微生物等生物大分子的检测。这些待检测物质通常包含多个识别位点，可以通过常规的夹心免疫测定法检测，但农药例如啶虫脒由于对分子量小，不足以同时结合两种抗体，不能用夹心免疫测定法检测。简单、灵敏、可靠的分析方法检测啶虫脒残留是农药残留检测领域亟待解决的技术问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种操作简单、快速、准确的检测啶虫脒的电化学传感器及其制备方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种用于检测啶虫脒电化学传感器的检测电极，所述检测电极包括金电极和由内至外依次包裹在所述金电极外的二氢硫辛酸活化层、啶虫脒抗体层和巯基己醇封闭层。优选的，所述二氢硫辛酸活化层是由二氢硫辛酸中的S与金电极表面通过Au-S键组装形成。本专利技术还提供了所述检测电极的制备方法，包括以下步骤：1)将清洁后的金电极浸泡于二氢硫酸锌的乙醇溶液，进行Au-S键自组装，在所述金电极表面形成二氢硫酸锌自组装层；2)在所述步骤2)中获得的二氢硫酸锌自组装层表面包覆含NHS和EDC的MES缓冲液，对所述二氢硫酸锌自组装层进行修饰活化，在所述金电极表面形成二氢硫辛酸活化层；3)在所述二氢硫酸锌活化层表面包覆啶虫脒捕获抗体溶液进行孵育，在所述DHLA活化层外表面形成啶虫脒抗体层；4)在所述啶虫脒抗体层外表面包覆MCH溶液进行封闭，在所述啶虫脒抗体层外表面形成MCH封闭层，得到检测电极。优选的，步骤1)中所述二氢硫辛酸的乙醇溶液的浓度为0.8～1.2mmol/L；所述浸泡的时间为1.5～2.5h。优选的，步骤3)所述含NHS和EDC的MES缓冲液的pH值为6.4～6.6；所述缓冲液中MES的浓度为0.09～0.11mol/L；NHS的浓度为4.5～5.5mmol/L；EDC的浓度为2.0～3.0mmol/L。优选的，步骤4)中所述捕获抗体溶液的浓度为8～12μgmL-1；所述孵育的时间为1.5～2.5h。优选的，所述孵育后还包括：对所述孵育得到的修饰层采用PBS洗涤，得到啶虫脒抗体层。优选的，步骤5)中所述MCH溶液的浓度为1.5～2.5mmol/L；所述封闭的时间为25～35min。本专利技术还提供了一种包括所述检测电极的电化学传感器，所述电化学传感器还包括匹配试剂，所述匹配试剂包括啶虫脒半抗原探针溶液和亚甲基蓝探针溶液。优选的，所述啶虫脒半抗原探针溶液浓度为5～10μmol/L。优选的，所述啶虫脒半抗原探针是利用混合酸酐法将啶虫脒半抗原与氨基化探针偶联获得的，所述氨基化探针的序列如SeqIDNo.1所示。优选的，所述亚甲基蓝探针的核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。优选的，所述亚甲基蓝探针溶液的浓度为5～15μM。本专利技术提供了所述的电化学传感器在检测啶虫脒中的应用。优选的，所述检测啶虫脒包括以下步骤：A)将待检样品和半抗原探针的混合液修饰检测电极表面，获得待检电极；B)向所述待检电极表面滴加亚甲基蓝探针溶液，所述亚甲基蓝探针溶液与半抗原探针互补修饰，获得带信号电极；C)以所述带信号电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt电极为对电极，进行差分脉冲伏安检测，根据得到的电信号和预定的标准曲线，得到所述待检样品中啶虫脒的含量。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的电化学传感器采用竞争型的检测模型，啶虫脒半抗原探针与啶虫脒竞争结合至捕获抗体上，实现了小分子的免疫检测，检测速度快；检出限为3.2ngL-1，检测更为灵敏，检测结果准确可靠；使用金电极，电极简便、小型化、易携带、可多次使用；并且所述的啶虫脒电化学传感器使用方法简单、快速，适用于食品安全中啶虫脒的在线检测。本专利技术提供的检测电极的制备方法通过自组装化学键以及生物免疫结合对金电极进行修饰，依次在金电极表面形成二氢硫辛酸活化层、啶虫脒抗体层和巯基己醇封闭层。电极制备方法简单，性能稳定，重复性好；制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求；采用表面修饰技术制备检测电极，并且制备检测电极材料的用量与浓度恰当，使得检测电极对环境温度的要求不明显，室温下使用即可。附图说明图1为本专利技术所述检测啶虫脒电化学传感器原理图，其中A为啶虫脒半抗原探针的制备流程图，B为分别检测啶虫脒样品与空白对照的流程示意图；图2为实施例1中电化学阻抗谱(EIS)的检测结果图；图3为实施例1中金电极CV检测结果图；图4为实施例2中控制实验的检测结果图；图5为实施例3中啶虫脒半抗原探针浓度优化的检测结果图；图6为实施例4中抗体浓度优化的检测结果图；图7为实施例5中采用差分脉冲伏安技术读取的电信号变化图；图8为实施例5中标准曲线检测结果图；图9为实施例6中特异性分析的检测结果图。具体实施方式本专利技术提供了一种用于检测啶虫脒电化学传感器的检测电极，所述检测电极包括金电极和由内至外依次包裹在所述金电极外的二氢硫辛酸活化层、啶虫脒抗体层和巯基己醇封闭层。在本专利技术中，所述检测电极以金电极为基础电极，对所述基础电极表面进行修饰得到，所述金电极外表面包裹有DHLA活化层，所述的DHLA活化层是DHLA与金电极表面通过Au-S键组装形成；在本专利技术中，所述DHLA活化层上的羧基是处于活化的状态；所述羧基在活化状态下与啶虫脒抗体结合。本专利技术中，所述检测电极包括包裹在所述DHLA活化层外表面的啶虫脒抗体层，所述啶虫脒抗体层是通过啶虫脒捕获抗体与活化的DHLA修饰连接形成，所述的啶虫脒捕获抗体为能够与啶虫脒反生特异性免疫识别的抗体；所述啶虫脒捕获抗体的Fc段与DHLA活化层上的羧基结合；本专利技术对所述捕获抗体的来源没有特殊限定。本专利技术中，所述检测电极还包括包裹在所述啶虫脒抗体层外表面的MCH封闭层，所述的MCH封闭层是用MCH将未与啶虫脒抗体结合的活化的DHLA封闭，以减少非特异性吸附。本专利技术所述的检测电极可以与啶虫脒或者啶虫脒半抗原探针发生特异性免疫结合。本专利技术还提供了所述检测电极的制备方法，包括以下步骤：1)将清洁后的金电极浸泡于二氢硫酸锌的乙醇溶液，进行Au-S键自组装，在所述金电极表面形成二氢硫酸锌自组装层；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测啶虫脒电化学传感器的检测电极，其特征在于，所述检测电极包括金电极和由内至外依次包裹在所述金电极外的二氢硫辛酸活化层、啶虫脒抗体层和巯基己醇封闭层。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测啶虫脒电化学传感器的检测电极，其特征在于，所述检测电极包括金电极和由内至外依次包裹在所述金电极外的二氢硫辛酸活化层、啶虫脒抗体层和巯基己醇封闭层。2.根据权利要求1所述的检测电极，其特征在于，所述二氢硫辛酸活化层是由二氢硫辛酸中的S与金电极表面通过Au-S键组装形成。3.权利要求1或2所述检测电极的制备方法，包括以下步骤：1)将清洁后的金电极浸泡于二氢硫酸锌的乙醇溶液，进行Au-S键自组装，在所述金电极表面形成二氢硫酸锌自组装层；2)在所述步骤2)中获得的二氢硫酸锌自组装层表面包覆含NHS和EDC的MES缓冲液，对所述二氢硫酸锌自组装层进行修饰活化，在所述金电极表面形成二氢硫辛酸活化层；3)在所述二氢硫酸锌活化层表面包覆啶虫脒捕获抗体溶液进行孵育，在所述DHLA活化层外表面形成啶虫脒抗体层；4)在所述啶虫脒抗体层外表面包覆MCH溶液进行封闭，在所述啶虫脒抗体层外表面形成MCH封闭层，得到检测电极。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述二氢硫辛酸的乙醇溶液的浓度为0.8～1.2mmol/L；所述浸泡的时间为1.5～2.5h。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述含NHS和EDC的MES缓冲液的pH值为6.4～6.6；所述缓冲液中MES的浓度为0.09～0.11mol/L；NHS的浓度为4.5～5.5mmol/L；EDC的浓度为2.0～3.0mmol/L。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述捕获抗体溶液的浓度为8～12μgmL-1；所述孵育的时间为...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐霞红，王新全，王祥云，齐沛沛，汪志威，徐浩，王强，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33