一种七甲川菁类活性荧光探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种七甲川菁类活性荧光探针及其制备方法与应用。结构通式如下：通式中:X=Ⅱ‑Ⅸ；R1、R2=(CH2)mCH3、(CH2)nOH、(CH2CH2O)pCH3、CH2C6H5；R3、R4=H、SO3H、SO3Na、SO3K；a‑g=2‑8；n、m、p=1‑10。本发明专利技术是基于近红外长波的七甲川菁类荧光染料，选择吲哚啉为芳香母核提高了荧光强度，甲川链中间环己烯刚性桥连增强了稳定性，同时利用具有化学反应活性位点的氮衍生物在七甲川菁母体染料中位进行亲核取代，大大增大斯托克斯位移、活性化学基团便于多种类型物质荧光标记等优点，该荧光探针为对称结构，简化了制备和提纯工艺，有利于降低成本。本发明专利技术可用作高灵敏蛋白、糖、DNA等生物分子和纳米载体的荧光标记探针，进行细胞或活体水平荧光成像。

A seven methylene cyanine active fluorescent probe and its preparation and Application

The invention relates to an active fluorescent probe of seven methyl cyanine and a preparation method and application thereof. The general structure is as follows: X= II: R1, R2= (CH2) mCH3, (CH2) nOH, CH2CH2O pCH3, CH2C6H5. The present invention is a seven methcyanine fluorescent dye based on the near infrared long wave, and the choice of indoline to enhance the fluorescence intensity of the aromatic nucleus. The rigidity of the middle cyclohexene bridge strengthens the stability. At the same time, the nitrogen derivative with the active site of the chemical reaction is replaced by the nucleophilic substitution in the middle of the seven methensesbania mother dye. The large Stokes displacement and active chemical groups are convenient for the fluorescence labeling of various types of substances. The fluorescent probe is a symmetric structure, which simplifies the preparation and purification process, which is beneficial to reduce the cost. The invention can be used as fluorescent labeling probes for biomagnets and nano carriers of highly sensitive proteins, sugars, DNA, and so on for cell or living body level fluorescence imaging.

【技术实现步骤摘要】
一种七甲川菁类活性荧光探针及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种七甲川菁类活性荧光探针及其制备方法与应用，具体是一种斯托克斯位移大于100nm的适用于高灵敏蛋白、糖、DNA等生物分子和纳米载体的荧光标记的荧光探针，进行细胞或活体水平荧光成像。
技术介绍
生物分子的荧光标记是继同位素标记后出现的快速方便的生物分子分析手段。随着生命科学的发展,迫切需要高灵敏度的分析检测方法。在医学上，以荧光技术为核心的酶促免疫分析法和荧光偏振免疫分析法已成为医学诊断的标准方法。在分子生物学上，利用激光共聚焦显微镜跟踪细胞内成分的位置和移动情况。此外，流式细胞仪以荧光技术为核心进行细胞的辨别和分类。随着纳米科技在医药领域的应用，利用靶向纳米荧光探针进行肿瘤诊断治疗成为研究的热点。荧光染料的开发是发展荧光分析技术的最具关键性的因素。目前使用较多罗丹明类、荧光素类、BODIPY类荧光染料，其最大吸收波长都在紫外可见区，而有些生物样品在这个区域有很强的吸收，荧光检测时造成很强的荧光背景，大大降低检测的灵敏度和准确度。多甲川菁染料的吸收和发射光谱区位于550-1200nm处(近红外荧光λem>600nm)，处于近红外区。相对于常规荧光探针(λem<600nm)而言,在近红外荧光光区,玻璃、聚丙烯酰胺凝胶基质和生物化学杂质的荧光背景很弱,信噪比高,背景干扰大大降低。而且它们有着很高的摩尔吸光系数和良好的荧光特性。并且由于散射光强度与波长的四次方成反比,随波长的增加,拉曼散射迅速减少,使散射干扰也大为降低，因此荧光检测的灵敏度很高。七甲川菁染料作为非常重要的近红外荧光探针是生物医学应用的焦点，前人针对这类染料的光稳定性和水溶性差等问题进行了很多结构上的优化。主要总结如下：(1)两端以吲哚啉为芳香母核性能最好；(2)GaborPatonay等在甲川链上引入刚性的环己烯结构，解决甲川链延长导致的光稳定性下降的问题，并且增强荧光强度；(3)ASWangger等在分子中引入磺酸基，提高稳定性和稳定性；(4)彭孝军等将七甲川染料中位用氮衍生物取代，使其在激发态发生分子内电荷转移效应，产生大斯托克斯位移，解决传统七甲川染料自淬灭问题。但是，目前近红外长波七甲川吲哚荧光探针在生物荧光分析方面的应用依然纯在一些问题。首先，能够通过化学反应进行荧光标记的七甲川菁荧光探针，通常带有羧基或琥珀酰亚胺活性酯，并且活性位点位于吲哚啉芳香母核上，整体为不对称结构，大大增加合成复杂性和分离提纯的难度。其次，目前商业化七甲川荧光染料活性位点种类单一，不能满足蛋白、DNA等生物活性分子，聚合物或无机纳米载体的标记需要。再次，目前商业化的七甲川菁荧光探针价格昂贵，需要优化合成路线和提纯工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型七甲川菁类活性荧光探针及其制备方法与应用，可以克服已有技术的缺陷。本专利技术是基于近红外长波的七甲川菁类荧光染料，选择吲哚啉为芳香母核提高了荧光强度，甲川链中间环己烯刚性桥连增强了稳定性，通过吲哚啉母核上磺酸基调控探针的水溶性。同时利用具有化学反应活性位点的氮衍生物在七甲川菁母体染料中位进行亲核取代，大大增大斯托克斯位移、活性化学基团便于多种类型物质荧光标记等优点，用于生物分子或纳米载体的荧光标记，将荧光光谱性能和细胞水平及活体水平上荧光成像作为研究重点。该荧光探针为对称结构，大大降低了合成的复杂性，简化了制备和提纯工艺，有利于降低成本。本专利技术可用作高灵敏蛋白、多糖、DNA等生物分子和有机无机纳米载体标记的荧光探针，进行细胞水平和活体水平上的检测及成像。本专利技术提供的七甲川菁类活性荧光探针结构通式如下：通式中:X＝Ⅱ-Ⅸ；R1、R2＝(CH2)mCH3、(CH2)nOH、(CH2CH2O)pCH3、CH2C6H5；R3、R4＝H、SO3H、SO3Na、SO3K；a-g＝2-8；n、m、p＝1-10。其中，a-g，n，m，p为相互独立的整数。本专利技术提供的新型七甲川菁类活性荧光探针的制备方法是经过下述步骤：1)首先，起始原料吲哚啉与烷基化试剂(碘乙烷或苄基溴)在氩气保护下，以甲苯为溶剂进行回流，发生季铵化反应，生成烷基取代的吲哚季铵盐中间体，其中吲哚啉与烷基化试剂的摩尔比为1:1.5-1:5；其次，以无水醋酸钠为催化剂，与2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯在无水乙酸酐中进行缩合反应，反应温度为25-70℃，得到带有环己烯氯的七甲川3H-吲哚菁母体染料，结构式如下：2)在氩气保护下，以无水甲醇为溶剂，N,N-二异丙基乙胺为缚酸剂，环己烯氯母体染料与含有不同化学反应活性位点的氮衍生物进行亲核取代反应，母体染料与氮衍生物的摩尔比为1:3，反应温度为40-70℃。反应完成后用无水乙醚沉淀，析出大量固体，以二氯甲烷/甲醇为洗脱液(V二氯甲烷：V甲醇＝20：1)，利用中压快速制备色谱纯化，得到目标染料。其中，X、R1、R2、R3、R4的取值如上述定义。本专利技术提供的新型七甲川菁类活性荧光探针具有大于100nm的斯托克斯位移，荧光量子产率最大值达0.4。吸收光谱与发生光谱没有镜像对称关系。与传统商业化Cy7荧光探针相比，最大吸收波长蓝移近130nm。由于中位引入化学活性基团，通过化学反应对蛋白、糖、DNA等生物分子或纳米载体进行荧光标记。在细胞水平和活体水平上的荧光成像，稳定性好，背景荧光低。因此，本专利技术可用作高灵敏蛋白、多糖、DNA等生物分子和有机无机纳米载体标记的荧光探针，进行细胞水平和活体水平上的检测及成像。本专利技术提供的新型七甲川菁类活性荧光探针具有许多优点：主要体现在三个方面：首先，中位氮衍生物取代，由于氮原子上孤对电子具有供电子能力，使荧光探针激发态时发生分子内电荷转移，使新染料的斯托克斯位移大于100nm，对于实际应用具有重要意义。目前用于荧光分析技术的七甲川荧光探针斯托克斯位移一般为25nm左右，小斯托克斯位移的荧光染料吸收光谱与发射光谱有很大重叠，导致自淬灭，即部分发射光被自身吸收使荧光强度下降。另外，小斯托克斯位移还会造成荧光分析的测量误差。因为，小斯托克斯位移使激发光波长与荧光检测波长过于接近，激发波长易对荧光检测狭缝造成散射干扰。其次，本专利技术的荧光探针引入马来酰亚胺、二硫键、叠氮、丙烯酰胺等化学活性基团，能够适用于多种生物分子或有机无机材料的荧光标记。再次，本专利技术的荧光探针为对称结构，大大降低了合成的复杂性，简化了制备和提纯工艺，有利于降低成本。总之，本专利技术的此类七甲川菁类荧光探针，整合吲哚啉芳香母核提高荧光强度、刚性环己烯桥连提高探针稳定性、中位氮取代大大增大斯托克斯位移、活性化学基团便于多种类型物质荧光标记等优点，可用作高灵敏蛋白、多糖、DNA等生物分子和有机无机纳米载体标记的荧光探针，进行细胞水平和活体水平上的检测及成像。附图说明图1为2-a-a荧光探针的紫外吸收和荧光发射光谱。图2为聚合物纳米粒N-1和N-2荧光光谱。图3为树突细胞(DCs)对N-1纳米粒的胞吞。图4为N-1纳米粒活体成像。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步详细阐述本专利技术。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种七甲川菁类活性荧光探针七甲川菁类活性荧光探针，其特征在于该探针的结构通式如下：

【技术特征摘要】
1.一种七甲川菁类活性荧光探针七甲川菁类活性荧光探针，其特征在于该探针的结构通式如下：通式中:X=Ⅱ-Ⅸ；R1、R2分别为：(CH2)mCH3、(CH2)nOH、(CH2CH2O)pCH3、CH2C6H5；R3、R4分别为：H、SO3H、SO3Na、SO3K；a，b,c,d,e,f,g分别为：2-8；n、m、p分别为：1-10;其中，a，b,c,d,e,f,g，n，m，p分别为相互独立的整数。2.权利要求1所述的七甲川菁类活性荧光探针的制备方法，其特征在于经过下述步骤：1）首先，起始原料吲哚啉与烷基化试剂在氩气保护下，以甲苯为溶剂进行回流，发生季铵化反应，生成烷基取代的吲哚季铵盐中间体，其次，以无水醋酸钠为催化剂，与2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯在无水乙酸酐中进行缩合反应，反应温度为25-70℃，得到带有环己烯氯的七甲川3H-吲哚菁母体...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄平升，王伟伟，秦怡博，孔德领，
申请(专利权)人：中国医学科学院生物医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12