用于转基因番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供一种用于检测转基因番木瓜YK16‑0‑1转化体纯杂合的引物组，属于生物技术领域。所述引物组包括以下三条引物：1601‑GF：5’‑AGAGAACATCTGGTGGTATC‑3’，1601‑TR：5’‑CTCATTAAACTCCAGAAACC‑3’，1601‑GR：5’‑AGACATATATCATCAAGACCATAGTAG‑3’。本发明专利技术还提供基于上述引物组的试剂盒、检测方法。本发明专利技术所提供的引物组可检测待测番木瓜个体材料中是否含有YK16‑0‑1转化体，并鉴别出该品种中特定个体的纯杂合状态，适合于纯合度检测和育种选种。

Primer set, kit and method for pure heterozygosity identification of transgenic papaya YK16-0-1 transformants

The invention provides a primer group for detecting pure heterozygosity of transformants of YK16 carp papaya, YK16 0 1, and belongs to the biotechnology field. The primer group includes the following three primers: 1601 GF:5 'AGAGAACATCTGGTGGTATC, 3', 1601 TR:5 'CTCATTAAACTCCAGAAACC 3', 1601 GR:5 'GR:5' AGACATATATCATCAAGACCATAGTAG 3 '. The invention also provides a kit and a detection method based on the primer group. The primer group provided by the present invention can detect whether the individual material of the papaya is contained in the YK16 0 conversion 1 transformation body, and identifies the pure heterozygous state of the particular individual in the variety, and is suitable for the pure compatibility detection and breeding selection.

【技术实现步骤摘要】
用于转基因番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的引物组、试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种用于转基因番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
转基因番木瓜是目前我国种植的两种主要转基因作物之一，2016年我国转基因番木瓜种植面积为8550公顷，比2015年的7000公顷增加了22％。转基因番木瓜YK16-0-1是1996年叶东锡等人将番木瓜环斑病毒(PRSV)的外壳蛋白基因通过农杆菌介导的方法导入到番木瓜基因组中所获得的，能够产生对番木瓜环斑病毒的良好抗性。2012年对深圳市市售的转基因番木瓜检测表明，57份番木瓜样品中，转基因阳性率为91.2％，其中，YK16-0-1品系占96.1％。说明在我国转基因番木瓜中YK16-0-1转化体已有较大范围的种植和销售。转基因性状与其他生物性状一样，可以根据其自交或杂交产生后代中的分离情况来判定其是纯合或杂合。在育种过程中，获得纯合体是一个非常关键的步骤，也是保证种子质量的重要的因素。传统的区分转基因植株纯杂合方法是通过检测自交产生的子一代是否发生分离以及计算分离比进行的，不仅耗时费力，而且浪费了子一代的宝贵资源。而快速高效地筛选纯合植株，可显著加快转基因植株的育种进程，因此鉴别转基因植株纯杂合方法具有重要的应用价值。本领域亟需开发一套可快速、高效、便捷地鉴定筛选转基因番木瓜YK16-0-1纯杂合的方法。
技术实现思路
鉴于本领域存在的上述问题和需求，本专利技术分析了YK16-0-1转化体插入位点的番木瓜基因组序列，设计和验证了特异性的引物组合，建立了快速鉴定YK16-0-1转化体纯杂合的方法，可检测待测番木瓜材料是YK16-0-1转化体，并鉴别出特定个体的纯杂合状态。本专利技术提供的技术方案如下：用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的引物组，其特征在于，包括以下三条引物：1601-GF：5’-AGAGAACATCTGGTGGTATC-3’，1601-TR：5’-CTCATTAAACTCCAGAAACC-3’，1601-GR：5’-AGACATATATCATCAAGACCATAGTAG-3’。用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。所述试剂盒还包括用于进行PCR扩增的常规试剂，和/或，用于进行电泳检测的常规试剂。所述用于进行PCR扩增的常规试剂包括：dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液、超纯水，或包含上述物质的商品化PCR反应混合液；所述用于进行电泳检测的常规试剂包括：电泳缓冲液、核酸染料、琼脂糖凝胶；所述用于进行电泳检测的常规试剂还包括DNAMarker；所述核酸染料指溴化乙锭；所述商品化PCR反应混合液指GoGreenMasterMix。用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的方法，其特征在于，包括：采用所述的引物组，和/或，所述的试剂盒对待测番木瓜材料的DNA进行PCR扩增。所述PCR扩增的反应体系为：GoGreenMasterMix0.5μL/μL，引物0.5μmol/L，所述待测番木瓜材料的DNA模板0.1μL/μL，其余为超纯水；所述PCR扩增的反应程序：95℃预变性4min，以95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s为1个循环，共进行35个循环，72℃保温10min。所述方法还包括：将所述PCR扩增结果进行电泳检测，判读电泳检测结果。所述电泳指：将PCR扩增产物置于质量体积比为0.8％的琼脂糖凝胶上，于120V电压下电泳20分钟；所述判读电泳检测结果指：如果电泳结果仅出现300bp的条带，则待测的番木瓜材料样品含有纯合的YK16-0-1转化体；如果电泳结果同时出现300bp和202bp的条带，则待测的番木瓜材料样品含有杂合的YK16-0-1转化体；如果电泳结果仅出现202bp的条带，则待测的番木瓜材料样品不含有YK16-0-1转化体。所述引物组在制备番木瓜YK16-0-1转化体检测试剂方面的用途，其特征在于，在标有番木瓜YK16-0-1转化体检测用途的商品包装盒内放入如SEQNO.ID1-3所示的3条引物。采用上述3条引物扩增待测番木瓜材料的基因组DNA并进行电泳检测扩增引物通过电泳条带显示可直观、快速地鉴别出待测番木瓜材料中是否含有YK16-0-1转化体，以及所含有的YK16-0-1转化体的纯杂合类型；现有技术中通常的YK16-0-1转化体定性检测方法只能检测出是否含有YK16-0-1转化体，但并不能进一步获知YK16-0-1转化体的纯杂合类型；而本专利技术申请日前获知YK16-0-1转化体纯杂合类型的常规手段是通过番木瓜材料自交或杂交产生后代中的分离情况来判定其是纯合或杂合，这种方法明显过程繁琐冗长、费时费力。采用本专利技术的引物组，可以在番木瓜植株生长的任一阶段取样提取DNA，利用PCR和电泳即可快速便捷得获知YK16-0-1转化体是否存在以及纯杂合类型，省时省力，具有显著的进步。不仅如此，本专利技术还验证了所述引物组及相关的PCR检测YK16-0-1转化体的准确率，发现采取上述引物组进行PCR定性检测的结果与常规自交、杂交方法获知的YK16-0-1转化体纯杂合类型完全一致，由此可知，本专利技术的引物组不仅开创性地通过分子生物学方法可快速检测YK16-0-1转化体的纯杂合类型，而且还能保证非常高的准确率。本领域技术人员熟知，上述引物可通过人工序列合成制备得到，存在状态可以是粉状、或溶液状的。本专利技术的第二个方面提供一种用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的试剂盒，其特征在于，包括所述的引物组。采用基于上述引物组的试剂盒，也能解决定性检测番木瓜材料中YK16-0-1转化体及其纯杂合类型的问题，获得同样的效果。在进一步的方案中，所述试剂盒还包括用于进行PCR扩增的常规试剂，和/或，用于进行电泳检测的常规试剂。具体地，所述用于进行PCR扩增的常规试剂包括：dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液、超纯水，或包含上述物质的商品化PCR反应混合液；所述用于进行电泳检测的常规试剂包括：电泳缓冲液、核酸染料、琼脂糖凝胶；更进一步地，所述用于进行电泳检测的常规试剂还包括DNAMarker；所述核酸染料指溴化乙锭；所述商品化PCR反应混合液指GoGreenMasterMix。基于所述引物组和试剂盒，采用包含上述步骤的方法，即可快速省力地从番木瓜材料中获知是否存在YK16-0-1转化体以及YK16-0-1转化体的具体纯杂合类型。本专利技术的第三个方面提供了一种用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的方法，其包括：采用所述的引物组，和/或，所述的试剂盒对待测番木瓜材料的DNA进行PCR扩增。具体地，所述PCR扩增的反应体系为：GoGreenMasterMix0.5μL/μL，引物0.5μmol/L，所述待测番木瓜材料的DNA模板0.1μL/μL，其余为超纯水；所述PCR扩增的反应程序：95℃预变性4min，以95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s为1个循环，共进行35个循环，72℃保温10min。进一步地，所述方法还包括：将所述PCR扩增结果进行电泳检测，判读电泳检测结果。更具体地，所述电泳指：将PCR扩增产物置于质量体积比为0.8％的琼本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于番木瓜YK16‑0‑1转化体纯杂合鉴定的引物组，其特征在于，包括以下三条引物：1601‑GF：5’‑AGAGAACATCTGGTGGTATC‑3’，1601‑TR：5’‑CTCATTAAACTCCAGAAACC‑3’，1601‑GR：5’‑AGACATATATCATCAAGACCATAGTAG‑3’。

【技术特征摘要】
1.用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的引物组，其特征在于，包括以下三条引物：1601-GF：5’-AGAGAACATCTGGTGGTATC-3’，1601-TR：5’-CTCATTAAACTCCAGAAACC-3’，1601-GR：5’-AGACATATATCATCAAGACCATAGTAG-3’。2.用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于进行PCR扩增的常规试剂，和/或，用于进行电泳检测的常规试剂。4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述用于进行PCR扩增的常规试剂包括：dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液、超纯水，或包含上述物质的商品化PCR反应混合液；所述用于进行电泳检测的常规试剂包括：电泳缓冲液、核酸染料、琼脂糖凝胶。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述用于进行电泳检测的常规试剂还包括DNAMarker；所述核酸染料指溴化乙锭；所述商品化PCR反应混合液指GoGreenMasterMix。6.用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的方法，其特征在于，包括：采用权利要求1所述的引物组，和/或，权利要求2-5任一所述的试剂盒对待测番木瓜材料的DNA进行P...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢家建，彭于发，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11